超聲法提取藏藥唐古特烏頭中多糖的研究

藏藥唐古特烏頭為毛茛科植物唐古特烏頭[Aconitumtanguticum(Maxim.)Stapf]的干燥全草。夏末秋初開花期連根采挖，除去雜質,陰干。具有清熱解毒、生肌收口、燥濕的功能。主治傳染病引起的發熱、肝膽熱病、血癥、胃熱、瘍瘡、蛇蝎咬傷以及黃水病[1]。

多糖類物質廣泛存在于動物、植物和微生物細胞壁中，是生命有機體的重要組成部分，是除核酸和蛋白質以外的又一類重要的生物分子。研究表明多糖類物質具有多種生物活性，如抗腫瘤、免疫、降血糖和抗病毒等，而且對機體幾乎無毒副作用[2～5]。

作者在此研究了藏藥唐古特烏頭中多糖的最佳提取條件，用硫酸-苯酚法測定唐古特烏頭中多糖的含量，以期為唐古特烏頭的進一步研究和資源開發利用提供科學依據。

1 實驗

1.1 藥材、試劑和儀器

藏藥唐古特烏頭Aconitumtanguticum(Maxim.)Stapf(青海亞郎藏藥材公司)，洗凈，干燥,備用。

苯酚、葡萄糖(上海試劑三廠)、無水乙醇、濃硫酸等均為國產分析純。

譜析T6型紫外可見分光光度計； 上海安亭TDL-40B型離心機； 上海亞榮RE52型旋轉蒸發儀；天津泰斯特DK98-1型數顯恒溫水浴。

1.2 方法

1.2.1 藏藥唐古特烏頭多糖的提取

1.2.1.1 石油醚脫脂

稱取5.0 g 藏藥唐古特烏頭樣品于燒瓶中，加入100 mL 石油醚(沸程60～90℃)，在80℃的水浴中回流提取40 min，冷卻，離心，回收石油醚，重復2次，將脫脂后的藏藥唐古特烏頭殘渣揮干溶劑，備用。

1.2.1.2 回流提多糖

將脫脂后的藏藥唐古特烏頭粉碎至一定粒度，加入一定量蒸餾水，超聲提取一定時間，冷卻，4000 r· min-1離心5 min，抽濾，收集濾液，再將濾液在旋轉蒸發儀中濃縮。

1.2.1.3 Sevage法除蛋白

將濃縮的多糖溶液倒入錐形瓶中，加入三氯甲烷-正丁醇(5∶1)混合溶液20 mL，劇烈振蕩20 min，離心，收集上層溶液，重復操作，至離心后無蛋白質沉淀出現、通過紫外光譜檢測無蛋白質吸收為止(本實驗重復7次)。

1.2.1.4 乙醇沉淀多糖

將離心后的上層清液分別轉入量筒中,測量體積，按1∶6的體積比加入無水乙醇，得到乙醇含量為80%的一系列多糖混合溶液，靜置過夜，抽濾，濾渣真空干燥，得到藏藥唐古特烏頭多糖產品。

1.2.2 提取條件的優化

根據藏藥唐古特烏頭中多糖的極性大等特點，以提取液中多糖含量為優化指標，對提取時間、料液比(質量比，下同)和藥材粒度等3個因素進行考察，每個因素取3個水平，根據L9(34)正交表進行實驗，因素與水平見表1。

表1 正交實驗的因素與水平

1.2.3 多糖含量的測定

1.2.3.1 測定波長的選擇

多糖含量的測定有硫酸-蒽酮法和硫酸-苯酚法等，研究表明硫酸-苯酚法的穩定性高于硫酸-蒽酮法[6]。以葡萄糖為標準品，精密吸取1.0 mL標準品溶液，置于50 mL 燒杯中，加入4%的苯酚溶液1 mL，振蕩搖勻，然后加入7 mL 濃硫酸并搖勻。顯色35 min。置于比色皿中，在波長400～600 nm之間測定吸收光譜，確定最大吸收波長為486 nm。

1.2.3.2 標準曲線的繪制

精密稱取干燥至恒重的葡萄糖100 mg，加適量蒸餾水溶解、定容至100 mL，作為葡萄糖標準溶液備用。精確量取葡萄糖標準溶液1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL和10.0 mL，分別定容至100 mL，再分別取1 mL于50 mL燒杯中，加入4%的苯酚溶液1 mL，振蕩搖勻，然后加入7 mL 濃硫酸并搖勻。顯色35 min。在486 nm處測量吸光度值，以吸光度值A為縱坐標、濃度c(μg· mL-1)為橫坐標繪制標準曲線，得到回歸方程為：A=0.0054c+0.1417，R=0.9942。

1.2.3.3 藏藥唐古特烏頭提取液中多糖含量的測定

多糖產品用蒸餾水溶解，定容至500 mL，即為待測樣液。吸取1.0 mL樣液于100 mL容量瓶中，按1.2.3.2方法測得其吸光度值，由回歸方程計算藏藥唐古特烏頭提取液中多糖的含量。

2 結果與討論

2.1 最佳提取條件的確定

正交實驗結果與分析見表2。

2.1.1 直觀分析

由表2可知，各因素對藏藥唐古特烏頭中多糖提取的影響大小依次為：A>B>C,即料液比>提取時間>藥材粒度，料液比對提取液中多糖含量的影響較大，藥材粒度相對較小，各因素的最優水平組合為A3B2C2，即藥材粒度為8目、料液比為1∶16、超聲提取2 h。

表2 正交實驗結果與分析

2.1.2 方差分析(表3)

表3 正交實驗方差分析結果

由表3方差分析數據可知，因素A對指標有顯著影響，因素C無顯著影響，這與直觀分析結果基本一致。

2.2 工藝條件的驗證實驗

為了考察最佳提取條件的穩定性，按該工藝條件進行3次重復性實驗，結果見表4。

表4 工藝驗證實驗結果/%

由表4可知，藏藥唐古特烏頭提取液中多糖的平均含量為4.03%，RSD為0.16%，均優于正交實驗表中的任何一組，說明該工藝穩定可行。

3 結論

通過正交實驗，確定超聲法提取藏藥唐古特烏頭中多糖的最佳提取條件為：唐古特烏頭和水的質量比1∶16、超聲提取2 h、藥材粒度8目,在此條件下，提取液中多糖含量可達4.03%。該方法提取得率較高、穩定性好，可為藏藥唐古特烏頭藥效的進一步研究和資源開發利用提供科學依據。

參考文獻：

[1] 國家中醫藥管理局中華本草編委會.中華本草[M].上海:上海科學技術出版社,2001:307.

[2] 趙宇,黃曉霞.多糖類化合物提取工藝研究[J].甘肅科技縱橫,2006,35(2):223-224.

[3] 孫玉書,畢力夫,蘇秀蘭，等.多糖及多糖類藥物研究概況[J].內蒙古醫學院學報,2006,28(1):75-78.

[4] 石雪萍.植物多糖研究進展[J].糧食與油脂,2005，(8):8-11.

[5] 卓佳,趙浩如.近十年日本植物多糖提取純化技術的發明專利[J].藥學進展,2005,29(6):276-280.

[6] 鐘方曉,任海華,李巖.多糖含量測定方法比較[J].時珍國醫國藥,2007,18(8):1916-1917.