固定化重組細胞催化非天然二肽合成

近年來二肽已成為藥物、保健食品、食品添加劑工業的研發新熱點，應用前景廣闊。例如二肽經甲酯化和環化后生成哌嗪二酮衍生物，多種哌嗪二酮類化合物對DNA拓撲異構酶Ⅱ有特異性抑制作用[1]，可篩選為潛在的抗腫瘤藥物。目前，二肽合成多采用化學法，但是化學法合成二肽要求有保護和活化步驟，反應步驟長、副產物多[2]。利用酶作為催化劑合成二肽的工藝相對簡單，產品質量高，對環境友好，因而受到廣泛重視且部分品種已實現產業化。如荷蘭DSM公司和日本Tova Soda公司利用蛋白酶大規模合成增甜劑阿斯巴甜，目前年生產能力在1萬 t左右[3]。雖然蛋白酶被成功用于二肽合成，但其只能選擇性合成L-氨基酸衍生物，而不能轉化非天然氨基酸如D-苯甘氨酸[4]。

青霉素?；甘前牒铣煽股厣a中的關鍵酶，可以合成眾多的β-內酰胺抗生素[5,6]。此外，該酶在手性合成物拆分與合成方面也應用廣泛[7,8]。Khimiuk等[2]發現E.coli來源的青霉素G?；?Penicillin G acylase,PGA) 可用于酶法合成非天然的苯甘氨酸二肽,其合成過程如圖1所示[2]。

圖1 青霉素G酰化酶催化合成二肽

由于A.faecalis來源的 PGA在底物選擇性、熱穩定性、有機溶劑耐受性等方面具有獨特優勢[9,10]，催化性能優于E.coliPGA,因此，作者采用A.faecalisPGA的固定化重組細胞作為催化劑合成D-苯甘氨酸二肽，擬為其規?；阜ㄉa打下良好基礎。

1 實驗

1.1 菌株、試劑和儀器

產A.faecalisPGA的重組E.coli菌株由中國科學院袁中一研究員提供。

L-亮氨酸、L-異亮氨酸，生物純，上海求德生物化工有限公司；L-組氨酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸，生物純，上海化學試劑有限公司；D-苯甘氨酰胺(純度>99%)，浙江天臺藥業。

1100 Series型高效液相色譜儀，Agilent 公司；722S型可見分光光度計，上海菁華；HZ-8212S型恒溫振蕩水浴，華利達；自動控溫控pH值的酶催化反應裝置，自制。

1.2 方法

1.2.1 菌體細胞通透處理

離心收集細胞，在磷酸緩沖溶液(50 mmol·L-1，pH值7.8)中重懸浮。加入一定量的溴化十六烷基三甲基氯化銨(CTAB)，在攪拌條件下處理細胞。離心，去除上清液，得滲透處理的細胞。

1.2.2 重組細胞固定化

取處理的細胞懸浮于Tris-HCl緩沖溶液中(50 mmol·L-1,pH值8.0)，在37℃下依次加入10 mL 5% 海藻酸鈉及10 mL 15%聚乙烯醇，混合。將混勻物逐滴滴入含5% CaCl2的冷飽和硼酸溶液中，在4℃靜置72 h。抽濾去除硼酸溶液，用Tris-HCl緩沖溶液清洗幾次。

包埋細胞和終濃度2%(體積分數)的戊二醛在4℃ 下交聯反應6 h，然后用Tris-HCl緩沖溶液(50 mmol·L-1,pH值8.0)清洗幾次，即得固定化細胞。

1.2.3 生物催化合成二肽

取50 mmol·L-1的D-苯甘氨酰胺和65 mmol·L-1的L-氨基酸，調pH值9.5，定容至20 mL，加入5 g固定化細胞進行反應，控制反應溫度為25℃、pH值為9.5。在反應不同階段定時取樣，參照Khimiuk等[2]方法用HPLC監測反應進程及各物質的含量。反應完畢，過濾去除固定化細胞，加入2 mol·L-1的H2SO4調pH值至5.0。靜置12 h，二肽逐漸沉淀析出，過濾，得目的產物。

反應液通過裝有XDB-C18柱的Agilent 1100系列HPLC液相色譜系統檢測。流動相：含40%(體積分數) 乙腈、0.7 g·L-1SDS的磷酸溶液(pH值3.5)，流速1.0 mL· min-1，柱溫 20℃，檢測波長208 nm。

1.2.4 酶活測定

酶活的測定采用PDAB法[11]：稱取一定量的固定化細胞，在37℃下預熱5 min，加入預熱的4%青霉素G鉀鹽溶液5 mL。反應5 min后立即取0.5 mL于空白試管中，加入3.5 mL PDAB顯色液顯色5 min，在415 nm下比色測定。

2 結果與討論

2.1 細胞通透處理及固定化載體選擇

由于青霉素G酰化酶在大腸桿菌中主要位于細胞周質內[12]，要提高固定化細胞的酶活性需先進行重組細胞通透處理，以減少細胞對酶的擴散限制。CATB可作用于大腸桿菌細胞的脂質和磷脂層[13]，導致細胞蛋白結構發生變化，進而增加細胞的通透性。通過優化CTAB處理條件，在0.3%(質量體積比)CTAB、25℃、處理75 min的條件下，細胞通透性增加了7.5倍。

不用戊二醛交聯的聚乙烯醇固定化細胞酶活雖較高[21.8 U·(g濕載體)-1]，但在堿性反應條件下穩定性較差，批反應次數較少。采用戊二醛交聯聚乙烯醇固定化細胞雖酶活降低約1/3，但是固定化細胞穩定性好、硬度高，形成多空顆粒，且細胞大小基本相同，呈規則的球形。在pH值10、50℃下催化青霉素G鉀鹽的重復利用實驗中，每150 min為一批次，使用15批次基本沒有酶失活，重復31批次后仍保留65%的酶活，37批次后仍有較好的彈性和較高的硬度[14]。此外，還嘗試了采用海藻酸鈉固定法及海藻酸鈉-明膠交聯法固定細胞，獲得的催化劑在硬度、穩定性等方面均相對較差。

2.2 HPLC檢測方法的建立

產物形成過程均采用HPLC方法監測，大多可形成4個有規律的峰。以D-Phenylglyl-L-isoleucine為例，其HPLC圖譜見圖2。

Ⅰ.D-Phenylglycine Ⅱ.L-Isoleucine Ⅲ.D-Phenylglycine amide Ⅳ.D-Phenylglyl-L-isoleucine

反應過程中各物質的保留時間見表1。

表1 HPLC分析中各物質的保留時間/min

2.3 二肽合成反應過程解析

由于D-苯甘氨酰胺本身就是青霉素G?；傅乃獾孜铮苑磻到y中除了D-苯甘氨酰胺與L-氨基酸生成二肽的合成反應外，還存在D-苯甘氨酰胺自身被酶水解生成D-苯甘氨酸和氨氣的反應以及合成的二肽被酶水解的反應，故整個反應中D-苯甘氨酸為主要反應副產物，應盡量避免該副產物的形成。在此，為減少D-苯甘氨酰胺的水解，采用L-氨基酸底物過量的方法。

以D-苯甘氨酰胺為固定底物，利用固定化A.faecalisPGA重組細胞為催化劑，選取不同L-氨基酸進行二肽合成實驗，其中幾種效果較好二肽的合成過程見圖3。

a.D-Phenylglyl-L-glycine b.D-Phenylglyl-L-isoleucine c.D-Phenylglyl-L-alanine

d.D-Phenylglyl-L-glutamic acid e.D-Phenylglyl-L-histidine f.D-Phenylglyl-L-leucine

圖3 固定化重組細胞催化合成二肽的過程圖

由圖3可以看出，采用固定化A.faecalisPGA重組細胞催化合成二肽時，反應速度較快。在相同反應條件下，反應15 min時，除D-Phenylglyl-L-glycine的濃度為10.39 mmol·L-1(液相得率20%)外，其余5種二肽的濃度均超過25 mmol·L-1，即液相得率超過了50%。

整個反應過程中,主要副產物D-苯甘氨酸生成的過程曲線大致相似，開始時由于參加二肽合成的L-氨基酸濃度較高，酶主要催化二肽合成反應，故副產物D-苯甘氨酸的生成量較少;隨著反應時間的延長，游離的L-氨基酸轉化為相應二肽而濃度變小，進而D-苯甘氨酰胺的水解反應速度加快，副產物D-苯甘氨酸濃度逐漸加大。因此,在選取固定底物D-苯甘氨酰胺與游離L-氨基酸的摩爾比時，加大游離L-氨基酸摩爾量 [理論上n(D-苯甘氨酰胺)∶n(氨基酸)=1∶1.5]可使D-苯甘氨酰胺盡可能多地參加二肽合成反應，在一定程度上減少副產物D-苯甘氨酸的生成。

由圖3還可以看出，二肽合成與副產物D-苯甘氨酸生成存在一定的關系，6種非天然二肽獲得最大生成量的時間均在反應6 h左右。當達到最大產物量后，產率穩定持續一段時間或開始逐漸下降。相對應的，副產物D-苯甘氨酸的生成量開始逐漸加大。當二肽合成獲得最大得率時，副產物D-苯甘氨酸的得率均為5 mmol·L-1左右，相當于10%的D-苯甘氨酰胺參加了水解反應。

Khimiuk等[2]認為在副產物D-苯甘氨酸濃度10%左右終止反應較為合適。本實驗發現，D-苯甘氨酸濃度在10%左右時，雖可獲得最大二肽得率，但反應時間較長(6 h)。鑒于二肽合成反應初期速率較快、副產物D-苯甘氨酸較少，從經濟角度考慮，作者認為終止反應的時間在60 min左右較為合適，此時D-苯甘氨酸量少，易與目的產物分離。

青霉素G?；傅孽；B接位點對苯乙酸及其衍生物有高度選擇性，也可以接受苯甘氨酸派生物作為?；w。相反地，其親核連接端對大部分氨基酸的L-異構體具有廣泛的選擇性，因此，青霉素G?；冈诤铣蒁-苯甘氨酸二肽方面具有獨特的優勢[2,3]。

2.4 二肽合成的結果比較

二肽合成的最高液相得率、實際產品分離率、反應后殘余酶活(20 h)比較見表2。

表2 二肽合成的結果比較/%

由表2可以看出，6種二肽合成過程獲得的最高液相得率較高，均超過80%，D-Phenylglyl-L-histidine的液相得率甚至超過90%。將反應溶液的pH值降至5.5左右時，雖然產物逐漸析出，但是過濾干燥后稱量發現其實際的產品分離率均不高，其中最高的D-Phenylglyl-L-glycine二肽的實際產品分離率僅43%，近一半的二肽仍然在反應溶液中沒有析出。D-Phenylglyl-L-histidine二肽的實際產品分離率僅為19%，還有大約72%的產品沒有析出。

綜上所述，雖然固定化A.faecalisPGA重組細胞催化合成二肽具有反應速度快、液相得率較高的優勢，但是產品的實際分離率相對較低,產品的分離方法還有待深入研究。

由表2還可以看出，反應完畢后酶活丟失較少，酶活丟失最多的D-Phenylglyl-L-glutamic acid二肽合成反應，殘余酶活為85%，表明固定化細胞可重復使用。Shcherbakova等[15]發現E.coliPGA在高苯甘氨酰胺濃度下嚴重失活，苯甘氨酰胺濃度為100 mmol·L-1、反應100 min時，殘余酶活僅為25%左右。而以A.faecalisPGA為催化劑，同樣反應條件下的殘余酶活在62%左右，表明A.faecalisPGA在二肽合成方面比E.coliPGA具有更高的底物穩定性，應用潛力較好。

3 結論

選取具有代表性的6種L-氨基酸作為酰基受體，以D-苯甘氨酰胺作為酰基供體，采用固定化A.faecalisPGA重組細胞進行催化二肽合成的研究。結果表明，催化反應的速度較快，除D-Phenylglyl-L-glycine二肽開始時反應速率稍慢(15 min時液相得率20%) 外，其余幾種二肽的合成在反應15 min時液相得率均超過50%。合成的二肽基本在反應6 h時得到最高液相產率，均超過80%。雖然反應過程獲得的液相得率較高，但實際產品分離率并不高,關于產品的分離純化方法還有待繼續進行研究。

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