熒光法研究鈣離子存在下槲皮素與牛血清白蛋白的相互作用

槲皮素(Quercetin，Qct)是一種植物中廣泛存在的生理及藥理活性顯著的多羥基黃酮類化合物，具有防治心血管疾病、增強免疫、抗癌、抗菌、抗炎、抗病毒等功能[1～5],受到人們的廣泛關注[6]。其中槲皮素與生物大分子的相互作用成為研究的焦點。有研究者[7～9]用熒光光譜法研究了槲皮素和牛血清白蛋白相互作用的光譜特征,丁德智等[10]用熒光光譜法研究了槲皮素和人血清白蛋白的相互作用，劉源[11]用熒光光譜法研究了黃酮類化合物(槲皮素)與核酸的相互作用，周新等[12]用親和毛細管電泳法測定了槲皮素與人血清白蛋白的結合常數，陳代武等[13]用熒光光譜法研究了碳納米管存在下槲皮素與牛血清白蛋白的相互作用，建立了“光內濾所致猝滅”的定量評估體系。

上述研究均只針對理想狀況下槲皮素與生物大分子的相互作用。然而，在生命體內存在大量金屬離子，這些離子勢必對槲皮素與生物大分子的相互作用產生影響。鑒于牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)是血漿中含量最豐富的重要載體蛋白，具有儲運內源性代謝產物和外源性藥物小分子等重要生理功能，作者先后探索了在模擬生理條件和金屬離子存在下喹若酮藥物與牛血清白蛋白的相互作用[14,15]。在此，采用熒光法研究在模擬生理條件和鈣離子存在下，槲皮素與牛血清白蛋白的相互作用規律。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

槲皮素，Alfa Aesar公司；牛血清白蛋白(BSA)，武漢天源生物技術有限公司；其它試劑均為國產分析純；實驗用水為超純水。

1.0×10-4mol·L-1的牛血清白蛋白溶液：取適量牛血清白蛋白溶于pH=7.4的0.05 mol·L-1Tris-HCl緩沖溶液(內含0.15 mol·L-1NaCl，以調節離子強度)，冰箱保存。

1.0×10-3mol·L-1槲皮素溶液：取適量槲皮素溶于無水乙醇；操作液濃度為4.0×10-5mol·L-1。

1.0×10-3mol·L-1CaCl2溶液，pH值 7.4的Tris-HCl 緩沖溶液。

F-4500型熒光分光光度計，日本日立公司。

1.2 方法

準確移取0.1 mL 1.0×10-4mol·L-1BSA溶液于10 mL比色管中，再分別加入一定量的槲皮素、鈣離子溶液，用水定容至刻度，搖勻。熒光分光光度計的激發和發射光柵狹縫均設置為5 nm，記錄激發波長為282 nm時混合溶液(在1 cm比色皿中)在290～550 nm范圍內的熒光光譜。

2 結果與討論

2.1 鈣離子、槲皮素存在下BSA的熒光光譜(圖1)

λex=282 nm，cBSA=cCa2+=cQct=1.0×10-6 mol·L-1

由圖1可知，BSA 的熒光峰位于340 nm處，分別加入相同濃度的鈣離子和槲皮素后，BSA 的熒光峰波長沒有發生變化，但熒光強度均有一定的降低，其中鈣離子致使BSA熒光降低的程度較緩，而相同濃度的槲皮素則使BSA熒光顯著降低。表明槲皮素和鈣離子分別可以與BSA發生相互作用。

2.2 槲皮素對BSA熒光的影響(圖2)

λex/λem=282 nm/340 nm，cBSA為1.0×10-6 mol·L-1，1～6.cQct(×10-6mol·L-1)為0,0.8,1.6,2.4,3.2,4.0

由圖2可知，隨著槲皮素濃度的增加，BSA的熒光強度明顯降低，且激發峰與發射峰的峰形基本不變，說明槲皮素對BSA的熒光有猝滅作用。

熒光猝滅的性質用Stern-Volmer方程[式(1)]來考察。

F0/F=1+Ksv·cQct=1+Kqτ0cQct

(1)

式中：F0是加入猝滅劑前BSA 溶液的熒光強度；F是加入猝滅劑后BSA 溶液的熒光強度；cQct是猝滅劑的總濃度;Ksv描述了生物大分子與熒光猝滅劑分子彼此擴散和相互碰撞到達動態平衡時的量效關系；Kq為雙分子表觀猝滅常數，反映體系中分子的彼此擴散和相互碰撞對生物大分子熒光壽命衰減速率的影響；τ0為猝滅劑不存在時熒光分子的平均壽命，生物大分子的平均壽命約為10-8s[16]。

按照實驗方法測出加入不同濃度的槲皮素后BSA熒光強度的變化，由式(1)繪制BSA熒光猝滅的Stern-Volmer 曲線(圖 2B)，由該直線斜率求出該體系的猝滅常數Kq為5.304×1013L ·mol-1·s-1。

一般說來，引起熒光猝滅的原因主要有動態猝滅和靜態猝滅。動態猝滅是一種能量轉移或電子轉移過程，不影響蛋白質的結構和生理活性；靜態猝滅則是由于發生了配合作用，通常是產生了不發熒光的配合物，對蛋白質的二級結構可產生影響，并可影響其生理活性。對于各類猝滅劑對生物大分子熒光的作用，其最大動態熒光猝滅常數約為 2.0×1010L·mol-1·s-1[17]。本研究所得到的猝滅常數為5.304×1013L ·mol-1·s-1，遠大于2.0×1010L ·mol-1·s-1。由此可推斷，槲皮素對BSA熒光的猝滅不是動態碰撞引起的，而是由于藥物和蛋白形成了配合物而導致的靜態猝滅。這一結論，與文獻報道一致[18]。

根據靜態猝滅理論，有：

log[(F0-F)/F]=logK+nlogcQct

(2)

式中:K為猝滅劑與BSA分子的結合常數；n為結合位點數。

以log[(F0-F)/F]對logcQct作圖得一直線，由直線斜率和截距求出槲皮素和BSA的結合常數為5.905×105L·mol-1、結合位點數為1.012。由所得的結合常數可以看出，槲皮素與BSA之間有較強的結合作用。

2.3 槲皮素-鈣離子對BSA熒光的影響(圖3)

λex/λem=282 nm/340 nm,cBSA=1.0×10-6 mol·L-1，1～7.cQct=cCa2+(×10-6 mol·L-1)為0,0.8,1.6,2.4,3.2,4.0,4.8

由圖3可知，隨著槲皮素-鈣離子濃度的增加，BSA的熒光強度較單用槲皮素降低更明顯，且激發峰與發射峰的峰形基本不變，說明槲皮素-鈣離子對BSA的熒光有猝滅作用。

同時，由式(1)繪制BSA熒光猝滅的Stern-Volmer曲線(圖3B)，由該直線斜率得到槲皮素-鈣離子猝滅BSA的猝滅常數Kq為8.672×1013L ·mol-1·s-1，也遠大于2.0×1010L ·mol-1·s-1，說明槲皮素-鈣離子猝滅BSA熒光的過程也為靜態猝滅。

以log[(F0-F)/F]對logcQct-Ca2+作圖，得一直線，由直線斜率和截距求出槲皮素-鈣離子和BSA的結合常數為1.245×106L·mol-1、 結合位點數為1.037。由所得的結合常數可以看出，槲皮素-鈣離子和BSA之間有較強的結合作用，較槲皮素與BSA之間的更強。

2.4 槲皮素-鈣離子猝滅BSA熒光的機理

將槲皮素-牛血清白蛋白、槲皮素-鈣離子-牛血清白蛋白體系的結合參數進行比較，結果見表1。

表1 二個體系結合參數的比較

由表1可知：(1)槲皮素和鈣離子共存下對BSA的猝滅程度和猝滅常數強于單用槲皮素；(2)槲皮素-鈣離子-BSA的結合常數大于槲皮素- BSA的結合常數；(3)槲皮素-鈣離子-BSA的結合位點數略多于槲皮素- BSA的結合位點數。

二個體系的參數存在明顯的差異，這可能是因為：(1)槲皮素和鈣離子協同猝滅BSA的熒光，即BSA熒光的猝滅是兩者各自猝滅的累加；(2)槲皮素與鈣離子形成配合物后再對BSA的熒光有猝滅作用。針對可能的機理，設置實驗予以探討。

一方面，配制系列槲皮素、鈣離子和槲皮素-鈣離子的溶液，加入到相同濃度的BSA溶液中，再按照實驗方法測定BSA的熒光強度。結果表明，在相同濃度的情況下，三個體系對BSA熒光的猝滅程度大不相同，以槲皮素-鈣離子最強、槲皮素次之、鈣離子最弱，并且槲皮素-鈣離子體系對BSA熒光的減弱值遠強于相同濃度下槲皮素和鈣離子對BSA熒光減弱值的加和。這說明，槲皮素-鈣離子猝滅BSA的熒光不是槲皮素和鈣離子各自猝滅的簡單累加。

另一方面，考察了樣品加入方式對BSA熒光猝滅的影響，分別采用槲皮素和鈣離子混合后加入BSA溶液、鈣離子加入BSA溶液混合后再加槲皮素溶液、槲皮素加入BSA溶液混合后再加鈣離子溶液等三種方式。結果表明，槲皮素與鈣離子混合對BSA熒光的減弱值最大，其它兩種方式的減弱值基本相仿但與前者有較大的差別。

基于上述分析，作者認為：在所研究的三元體系中，槲皮素與鈣離子形成配合物，鈣離子的存在促進了槲皮素與牛血清白蛋白的相互作用，這可能就是藥物在生理條件和金屬離子的存在下更易被蛋白質儲存和運輸的原因。

3 結論

通過熒光光譜法研究了鈣離子存在下槲皮素和牛血清白蛋白的相互作用。結果表明，同槲皮素一樣，槲皮素-鈣離子以形成配合物的方式靜態猝滅牛血清白蛋白的內源性熒光，鈣離子在一定范圍內對槲皮素與牛血清白蛋白的結合起著重要的作用。槲皮素與牛血清白蛋白、槲皮素-鈣離子與牛血清白蛋白的表觀結合常數/結合位點數分別為5.905×105L·mol-1/1.012、1.245×106L·mol-1/1.037。

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