微柱凝膠免疫法檢測人血中美洛西林針劑的IgM和IgG抗體

林觀樣，潘曉鋒，郭 紅，林聰麗

（溫州醫學院附屬第一醫院，浙江 溫州 325000）

美洛西林針劑中含有半抗原性質的化學成分，這些組分進入血液后可刺激機體產生相應的抗體，習慣上稱為美洛西林抗體。長期以來，國內外對美洛西林IgE抗體關注較多，而對美洛西林IgM和IgG抗體缺乏足夠重視。一方面，臨床上有些藥害事件與這些抗體密切相關；另一方面，臨床上又缺乏檢測IgM和IgG抗體的實用技術，給評估用藥人群中美洛西林的免疫狀況帶來困難。為此，筆者參考相關文獻[1-2]，嘗試用微柱凝膠免疫法測定美洛西林鈉的IgM和IgG抗體，現報道如下。

1 儀器與試藥

LISS/Coombs/IgG+C3d微柱凝膠卡（瑞士DiaMed公司，批號為50531.25.55）；卡式定速離心機（瑞士達亞美公司）；37℃恒溫孵育器（瑞士達亞美公司）。注射用美洛西林鈉（山東瑞陽制藥有限公司，批號為05101401）；pH為9.6的巴比妥緩沖液（自制）；O型血液（采自健康獻血者，肝素抗凝，冷藏備用）；待檢血液（采自住院患者和健康獻血者，肝素抗凝，冷藏備用）。

2 方法與結果

2.1 樣品制備

等份吸取20名O型血健康獻血者新鮮血液，混勻后取10 mL壓積紅細胞，置試管中，加90 mL生理鹽水，混勻，在2 000 r/min轉速下離心2 min，棄去上清液，用生理鹽水洗滌紅細胞3次，即成不含藥物的空白O型人紅細胞，備用。將1 g美洛西林鈉注射劑溶于pH為9.6的巴比妥緩沖液60 mL中，加入4 mL空白O型人紅細胞，室溫孵育1 h，用生理鹽水洗滌紅細胞3次，即成美洛西林化紅細胞。用適量生理鹽水配成2%紅細胞懸液，備用。按上述操作方法，用生理鹽水代替美洛西林鈉注射劑制成2%空白紅細胞懸液，作為陰性對照液，備用。將待檢血液在2 000 r/min轉速下離心2 min，取上清液即為待檢血清。吸取待檢血清適量，置56℃恒溫水浴箱中，保溫30 min滅活血清中的補體，作為補體滅活的血清對照組。

2.2 檢測方法

分別取2%美洛西林化紅細胞懸液40 μL置微柱凝膠柱上，加100 μL的待檢血清置37℃恒溫孵育器中，孵育20 min，置卡式定速離心機中以1 030 r/min的速度離心10 min，觀察凝集現象。同時，分別用2%空白紅細胞懸液及生理鹽水代替美洛西林化紅細胞懸液作對照，其余操作相同，記錄結果，考察抗原制備情況。另外，分別用補體滅活的血清及生理鹽水代替待檢血清，依次用美洛西林化紅細胞、空白紅細胞和生理鹽水測試，其余操作相同，記錄凝集結果，考察補體對本檢測方法的干擾情況。所有的凝集試驗都做2次。

2.3 陽性結果判定標準

離心后，紅細胞群完全沉積于凝膠柱底部者為陰性，停留于凝膠柱上部者為陽性，分布于凝膠柱中間者為弱陽性。微柱凝膠免疫結果見圖1。

圖1 微柱凝膠免疫結果圖

2.4 重復性試驗結果

76份待檢血清經2次平行檢測，判定為陽性7份，弱陽性2份，陰性67份。2次檢測結果中陽性、陰性比例完全一致，表現為陽性、陰性的血液標本號完全相同。2份弱陽性系紅細胞群在凝膠柱中的位置有點變化，經第3次重復試驗，結果還是弱陽性，因此計為陽性。

2.5 干擾試驗結果

待檢血清、補體滅活血清和生理鹽水對非美洛西林化紅細胞都表現為陰性，提示兩種血清對上述方法制備的多人混合的健康獻血者O型人紅細胞均無凝集反應。待檢血清、補體滅活血清和生理鹽水對美洛西林化紅細胞的凝集結果一致，表現為陽性、陰性的血液標本號完全相同（見表1），說明待檢血清中的補體及其他組分對陽性反應的結果沒有干擾。結合陰性對照組的結果，可確定陽性血清具有美洛西林鈉針劑抗原反應特性。

表1 76份血樣檢測結果中陽性結果的樣品號

2.6 樣品檢測結果

樣品1至50號為住院患者的血液標本，51至76號為健康獻血員的血液標本。在陽性血液中，有3例住院患者正在使用美洛西林鈉針劑，1例正在使用頭孢硫脒針劑，1例正在使用左氧氟沙星針劑，3例未使用過抗生素，還有1例為用藥史不詳的健康獻血者。在陰性血液中，有7例住院患者正在使用美洛西林鈉針劑，8例正在使用其他β-內酰胺類抗生素。

3 討論

當美洛西林針劑中的半抗原物質被紅細胞吸附后成為全抗原，這種抗原顆粒可被相應抗體橋連形成較大的團塊，在微柱凝膠中非特異性IgG作用下變成更大的團塊，以致不能通過凝膠柱中微小孔隙，從而停留于凝膠柱上端，表現為陽性結果。相反，被檢血清中如果沒有相應的抗體，紅細胞就會在離心力的作用下穿過凝膠柱，從而沉積于凝膠柱底部，表現為陰性結果。當藥敏化的紅細胞和相應抗體不是以最佳比例結合時，團塊可分布在凝膠柱中間，呈現弱陽性。本試驗中，有幾根凝膠柱出現上部和下部都有紅細胞群的現象。這可能是因為所用空白紅細胞來自多份血液，有些來源的紅細胞不易被美洛西林鈉針劑中半抗原物質致敏，因此不能與待檢血液中的相關抗體有效結合，最終在離心力作用下沉于凝膠底部。相反，另一部分被較好致敏的紅細胞則停留在凝膠柱上部。但也不排除是待檢血液中相應抗體滴度差別所致。

美洛西林皮膚過敏試驗主要是檢測美洛西林IgE抗體，但美洛西林IgE抗體反應陰性時，美洛西林IgM和（或）IgG仍可能是陽性。本研究的結果也證明了這一點，在接受美洛西林治療的10例患者中（皮膚過敏試驗均陰性），有3例呈IgM和（或）IgG抗體陽性。因此有必要在美洛西林皮膚過敏試驗的基礎上增加人血清美洛西林IgM和（或）IgG抗體的篩查。微柱凝膠免疫法方法簡便、結果穩定，可操作性強，適用于臨床檢驗工作。

[1]謝作聽，錢林利，陶志華，等.血清青霉素IgM和IgG抗體檢測方法的建立及評價[J]. 中華檢驗醫學雜志，2006，29（6）：527-528.

[2]渾守勇，劉明霞，王玉芝.微柱凝膠技術在紅細胞不規則抗體篩選中的應用[J]. 現代檢驗醫學雜志，2006，21（1）：37-38.