siRNA沉默survivin基因表達對惡性膠質瘤細胞放射敏感性的影響

張瞳光，杜利力，劉顯明，王厚中，于曉麗

（1.山東省青島市立醫院神經外科，山東 青島 266001； 2.山東省青島市商業醫院腫瘤內科，山東 青島 266071）

惡性膠質瘤是成人最常見的原發性惡性腦腫瘤，通常迅速導致患者死亡[1]，其治療方案仍局限于手術治療、化學治療、放射治療、免疫治療及其聯合治療。放射治療是目前惡性膠質瘤重要而有效的臨床治療手段之一，但副作用和并發癥限制了其臨床應用。因此，增加腫瘤細胞輻射敏感性，減少放射治療的副作用和并發癥具有重要的臨床意義。目前基因治療已經成為提高腫瘤放療敏感性的重要手段，具有廣泛的潛在臨床應用價值[2]。Survivin是新近發現的一個腫瘤特異性凋亡抑制因子，是凋亡抑制蛋白家族（inhibition of apoptosis proteins，IAPs）中作用最強的分子，具有抑制細胞凋亡和調節細胞周期的雙重功能，與惡性膠質瘤的發生、發展及預后密切相關[3-4]。已有文獻表明，survivin基因的高表達水平與惡性膠質瘤的放療抗性密切相關[5]。因此，抑制survivin基因表達有可能提高惡性膠質瘤細胞放療敏感性。筆者擬采用RNA干涉（RNAi）技術抑制survivin基因表達，觀察惡性膠質瘤細胞放療敏感性的變化，為臨床惡性膠質瘤的治療方法提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

惡性膠質瘤細胞株（U251）購自中國科學院上海細胞研究所，在含10%胎牛血清的1640培養基及37℃，5%CO2孵箱中培養。大腸桿菌JM109菌種為本室保存；DMEM培養基、TRIZOL試劑、脂質體LipofectamineTM2000和G418及T4 DNA連接酶均購自Invitrogen公司；新生小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；兔抗人survivin單抗、辣根過氧化物酶標記兔抗山羊IgG購自Santa cruz公司；RNA干涉載體pSilencer 4.0-CMV neo購自美國Ambion公司。DNA合成與測序由北京奧科生物技術有限工程公司完成。

1.2 方法

1.2.1 siRNA片斷的設計及合成

根據人survivin編碼區cDNA的序列（GenBank NM U75285）和載體設計的具體要求，shsurvivin 1：sense 5′-GATCCGAATTAACCCTTGGTGAATTTCAAGACGATTCACCAAGGGTTAATTCTTTTTTGAATTCA-3′；shsurvivin 2：sense 5′-GATCCGGACCACCGCATCTCTACATTCAAGACGTGTAGAGATGCGGTGGTCCTTTTTTGAATTCA-3′；片斷兩端有BamHⅠ和HindⅢ酶切位點，由北京奧科生物技術有限工程公司合成。

1.2.2 干涉載體的構建及鑒定

取 10 μL 重組質粒，10 ×K buffer 5 μL，HindⅢ和 BamHⅠ限制性內切核酸酶各1 μL，用無核酶三蒸水補足50 μL，37℃雙酶切6 h。酶切產物10 μL，2%瓊脂糖電泳。然后將細菌培養擴增，過夜培養細菌（搖至對數期），加無菌甘油，送北京奧科生物技術有限工程公司測序部，陽性克隆命名為pSil 4.1-shsurvivin 1，pSil4.1-shsurvivin 2 和 pSil 4.1-shcontrol（NC，non-specific shRNA，由美國Ambion公司提供）。

1.2.3 質粒轉染及細胞篩選

將惡性膠質瘤細胞（U251）1.5×105/孔接種于6孔板，24 h后覆蓋率達60%～70%時進行細胞轉染。按照脂質體LipofectamineTM2000說明書方法進行細胞轉染。轉染48 h后以800 μg/mL的G418篩選14 d，再以200 μg/mL的G418維持篩選，擴增細胞。穩定轉染的細胞分別命名為U251-s1，U251-s2和U251-NC。

1.2.4 RT-PCR檢測survivin mRNA表達

收集未轉染的或穩定的轉染細胞系（U251，U251-NC，U251-s1，U251-s2）。采用 TRIzol法提取細胞的總 RNA，操作步驟按說明書進行，然后取總RNA 2 μg進行反轉錄。survivin引物：上游引物為 5′-CAAGGACCACCGCATCTC-3′，下游引物為 5′-TCTCCGCAGTTTCCTCAA-3′（347 bp）。β -actin（內參）：上游引物為 5′-GGCATCGTGATGGACTCCG-3′，下游引物為 5′-GCTGGAAGGTGGACAGCGA-3′（594 bp）。產物經2%瓊脂糖電泳檢測。按公式分別計算細胞中suvivin mRNA表達的抑制率：抑制率=（1-U251-s2 survivin mRNA光密度值/U251-s2 β-actin mRNA光密度值）/（U251 survivin mRNA光密度值/U251-s2 β-actin mRNA光密度值）×100%。

1.2.5 Western blot檢測survivin蛋白表達

收集未轉染的或穩定的轉染細胞系（U251，U251-NC，U251-s1，U251-s2）。提取細胞總蛋白，經12%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，10%脫脂奶粉封閉 1 h，一抗為 1∶500稀釋的 survivin和 β-actin（Santa cruz公司），二抗為辣根過氧化物酶標記的1∶1000稀釋的IgG。PVDF膜依次與抗體作用后與免疫印跡化學發光試劑（ECL）反應。X線片曝光、顯影、定影后分析表達情況。按公式分別計算細胞中suvivin蛋白表達的抑制率：抑制率=（1-U251-s2 survivin蛋白光密度值/U251-s2 β-actin蛋白光密度值）/（U251 survivin蛋白光密度值/U251-s2 β-actin蛋白光密度值）×100%。

1.2.6 體外克隆形成試驗

收集未轉染的或穩定的轉染細胞系（U251，U251-NC，U251-s2）。按每皿1.0×104接種于60 mm的培養皿中，并繼續培養24 h。均采用西門子直線加速器MD7745（德國西門子公司生產）對細胞進行室溫下放射照射，劑量分別為 0，2，4，6，8 Gy。照射 24 h 后更換新的培養基。連續培養14 d后，酒精固定，再進行吉姆薩染色。細胞克隆計數并計算克隆形成率。

1.2.7 動物試驗

用100 μL的PBS稀釋1.0×107個未轉染或穩定轉染的細胞系（U251，U251-NC，U251-s2），分別注射于 8 周齡裸鼠皮下（雌雄各半，每組8只）。待皮下移植瘤直徑達7～8 mm左右時，采用西門子直線加速器MD7745分別給予放射照射治療3次，照射劑量為6.0 Gy。每隔3 d測量皮下瘤體積1次，按公式 V=0.4×長軸×短軸的平方計算體積。28 d后處死動物并測量皮下移植瘤體積。腫瘤體積抑制率=（1-U251-s2組平均皮下瘤體積/U251平均皮下瘤體積）×100%。

1.2.8 統計學處理

數據統計采用SPSS 13.0軟件。多組別樣本均數之間的比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示有統計學差異。

2 結果

2.1 重組質粒的酶切鑒定及測序

重組質粒經雙酶切后電泳結果證明，pSil 4.1-shsurvivin 1和pSil 4.1-shsurvivin 2真核表達載體構建正確，并且測序結果與所設計siRNA寡核苷酸鏈序列一致，表明重組干涉載體構建成功。

2.2 siRNA對survivin mRNA表達水平的作用

RT-PCR檢測siRNA對survivin mRNA表達水平的作用如圖1所示：相對于未轉染的U251細胞和陰性對照組U251-NC細胞（穩定轉染 pSil 4.1-NC載體），U251-s2細胞（穩定轉染pSil 4.1-shsurvivin 2載體）的survivin mRNA表達水平降低了約40.5%（P＜0.05），而U251-s1細胞 （穩定轉染pSil4.1-shsurvivin1載體）的survivin mRNA表達水平則沒有明顯變化（P＞0.05）。

圖1 RT-PCR檢測survivin mRNA結果

2.3 siRNA對survivin蛋白表達水平的作用

Western blot檢測siRNA對survivin蛋白表達水平的作用如圖2所示：相對于未轉染的U251細胞和陰性對照組U251-NC細胞，U251-s2細胞的survivin蛋白表達水平降低了約51.8%（P＜0.05），而U251-s1細胞的survivin蛋白表達水平則沒有明顯變化（P＞0.05）。鑒于pSil 4.1-shsurvivin 2對survivin基因表達顯著的干涉作用，選擇U251-s2細胞進行后面的試驗。

圖2 Western blot檢測survivin蛋白結果

2.4 shsurvivin 2對U251細胞體外放射敏感性的影響

為了檢測survivin基因下調后對惡性膠質瘤細胞（U251）體外放射敏感性的影響，進行了體外克隆形成試驗。結果如圖3所示：經照射后各組細胞生存率隨著放射劑量變化逐漸降低，U251和U251-NC細胞之間的克隆形成率無明顯差別（P＞0.05），而射線照射 4，6，8，10 Gy 時，U251-s2細胞的克隆形成率較另兩組細胞明顯降低（P＜0.05）。

2.5 shsurvivin 2對U251細胞體內放射敏感性的影響

圖3 細胞生存率變化

為了檢測survivin基因下調后對惡性膠質瘤細胞（U251）體內放射敏感性的影響，進行了皮下移植瘤試驗。結果如圖4所示：相對于對照組動物，U251-s2細胞皮下移植瘤動物組的瘤體積隨著時間變化抑制率逐漸增加，待28 d時抑制率達最大，為55.2%。

3 討論

Survivin是1997年Altieri等在人類基因組庫的雜交篩選中首先分離并克隆出來的凋亡蛋白抑制因子（IAP）家族中的一個重要成員，全長14.7 kb，有4個外顯子和3個內含子[6]。Survivin基因編碼的蛋白質含有142個氨基酸，相對分子質量為16 200，僅含有單一的桿狀病毒IAP重復序列（baculovirus IAP repeat，BIR）功能區，通過抑制蛋白酶級聯反應過程中位于下游的caspase-3和caspase-7的活性，發揮凋亡抑制作用[7]。Survivin蛋白的生物學功能主要體現抑制細胞凋亡、參與細胞周期調控、促進細胞增殖、促進細胞有絲分裂、促進血管增生等方面，因此被認為是腫瘤發生發展過程中發揮重要作用的一個關鍵分子[8]。Survivin基因在多種惡性腫瘤包括胃癌、乳腺癌、結腸癌、肝癌等的腫瘤組織中呈現高表達狀態，而在這些腫瘤組織相對應的正常組織中并不表達survivin[9-12]。同時多篇文獻還報道，survivin基因的高表達與腫瘤細胞的化療抗性和放療抗性密切相關；而胰腺癌放療抵抗與survivin的高表達密切相關[13]。Sasaki等[14]研究表明，survivin基因的高表達水平和臨床惡性膠質瘤患者的預后不佳密切相關。但是，惡性膠質瘤的放射敏感性與survivin表達之間的關系尚未見報道。

目前，基因功能研究的方法有多種，如基因敲除、反義寡核苷酸技術等，但費時費力，成本昂貴，且成功率不高。新近發展起來的RNA干涉技術，能快速有效地沉寂靶基因表達，進而從反向角度來闡明基因的功能，已成為當前研究的熱點[15]。目前應用的RNA干涉技術主要有體外合成siRNA片斷和DNA干涉載體兩類，前者的缺陷在于轉染效率低及RNA干涉作用的瞬時性，后來發展的DNA載體在細胞內表達的siRNA技術具有穩定、長久等優點[16]。本研究中使用的真核表達載體pSilencer 4.1-CMVneo含有高轉錄活性的CMV啟動子，并攜帶有新霉素抗性基因，便于細胞內高效轉錄siRNA和穩定篩選干涉后的細胞。筆者根據siRNA序列設計原則和文獻報道合成了兩條shRNA序列，通過酶切鑒定及測序證明載體構建成功；同時，選擇Ambion公司提供的與人類無同源性的shRNA干涉載體作為陰性對照。對于G418篩選出來的穩定轉染細胞系，分別通過RT-PCR及Western blot方法分析了survivin mRNA和蛋白水平的變化，結果表明pSil 4.1-shsurvivin 2具有抑制survivin基因表達的作用，而pSil 4.1-shsurvivin 1則沒有作用，因此選擇U251-s2作為細胞研究模型。

通過體外克隆形成試驗和皮下移植瘤試驗，發現survivin基因表達下調能夠顯著增強膠質瘤細胞體內外放療敏感性。這可能與survivin基因表達下調引起caspase-3和caspase-7活性增加有關，但具體機制還需要進一步的深入探討和分析。總之，本研究表明，聯合應用針對survivin為靶點的基因治療和放射治療能顯著抑制惡性膠質瘤細胞的增殖，同時又能避免放射劑量過大引起的副作用和并發癥，為惡性膠質瘤臨床治療開辟了新的思路。

圖4 皮下移植瘤試驗

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