Y染色體微缺失與男性無精少精的相關關系

葉長爛,江悅華,王 捷,張中芬,吳小麗,鄭 霖

(廣州軍區廣州總醫院醫學實驗科,廣州510010)

男性不育是一種常見疾病。影響男性不育的因素有很多,其中Y染色體微缺失是其中一個重要致病因素。Yq11.23上含有與精子發生相關的基因,稱為無精子因子(AZF),分為 AZFa、AZFb、AZFc、AZFd四個區域,上述區域缺失或點突變會導致男性不育。本研究采用多重PCR法,對男性不育患者進行Y染色體AZF檢測,分析AZF與男性不育的相關關系,為男性無精、少精的臨床治療提供重要依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2006年1月-2008年1月來我院就診的無精少精男性不育患者151例,其中無精癥患者 25例,少精癥126例(注:無精癥、少精癥診斷按WHO精液常規分析標準),患者年齡24歲-51歲,平均33歲。40例正常生育男性為對照組。

1.2 方法

1.2.1 全血DNA提取 抽取患者外周血2 ml,肝素鋰抗凝,利用全血DNA快速提取試劑盒(深圳亞能生物技術有限公司)從抗凝全血中提取基因組DNA。

1.2.2 引物 由深圳亞能生物技術有限公司合成,共有15對引物和一對內控引物,組成4套PCR多重系統。具體位點及相應區域見表1。

表1 AZF PCR引物位點及擴增片斷大小

1.2.3 PCR擴增 試劑由深圳亞能生物技術有限公司提供:取加入了PCR反應液Ⅰ-Ⅳ各14 μ l PCR反應管四支,在管壁上做好標記,而后分別加入已提取的樣本 DNA 4 μ l(約 0.15 μ g),加入無菌水至 25 μ l反應總體系。每次檢測都應同時設立一組陽性對照(正常男性基因組DNA)及陰性對照(女性基因組DNA)。按以下條件進行擴增:50℃10 min;95℃15 min;94℃30 s,58℃60 s,72℃60 s,34 cycles;72℃10 min。

1.2.4 電泳檢測 取 10 μ l PCR產物加 2 μ l 6×上樣緩沖液混合均勻后經2%瓊脂糖電泳,在紫外燈下觀察結果,使用BIO-RAD凝膠成像系統成像。

2 結果

40例正常男性基因皆未發現AZF缺失,見圖1。受檢的151例無精少精患者中,共檢出AZF缺失8例,總缺失率為5.3%,見表2。其中25例無精癥不育患者中,AZF缺失3例,缺失率為12%,皆為AZFc全部缺失(SY254、SY242、SY255、SY239 全部缺失)+AZFd部分缺失(SY152缺失),見圖2;126例少精癥不育患者,AZF缺失5例,缺失率為4.0%,其中4例為AZFc全部缺失(SY254、SY242、SY255、SY239 全部缺失)+AZFd部分缺失(SY152缺失),1例AZFb部分缺失(SY143缺失)+AZFd部分缺失(SY152缺失),見圖3。

3 討論

圖1 正常男性AZF電泳圖

表2 患者組Y染色體微缺失情況

圖2 AZFc+AZFd缺失

圖3 AZFb+AZFd缺失

據WHO統計,育齡夫婦中有10%-15%不育,其中男方因素占40%-50%,而與遺傳因素相關的男性不育患者約占30%[1],其中Y染色體微缺失是除Klinefelter's綜合征外導致男性不育的第二大原因[2]。早在1976年,Tiepolo等首次報道了人類Y染色體長臂1區1帶(Yq11)存在著精子生成基因或基因家族——AZF家族,到目前為止,已發現Y染色體長臂內至少存在4個互不重疊區域與精子發生有關,即 AZFa、AZFb、AZFc、AZFd 四個區域 ,各區域內又包括若干AZF侯選基因,其缺失或點突變可引起精子異常,導致男性不育。

根據所選取不育患者范圍的不同,Y染色體微缺失發生率為1%-55%[3]。本研究151例無精少精患者中,發現8例Y染色體微缺失,缺失率為5.3%,其中25例無精癥患者中,檢出AZF缺失3例,缺失率為12%;126例少精癥患者,AZF缺失5例,缺失率為4.0%.。在檢出的AZF缺失中,AZFc和AZFd為缺失熱區,8例AZF缺失中皆檢出有AZFd的SY152缺失;AZFc全部缺失者(SY254、SY242、SY255、SY239全部缺失)有7例,另外有1例AZFb部分缺失(SY143缺失)。本研究共檢出3個AZF區域位點、兩種類型缺失,即AZFc全部缺失+AZFd部分缺失、AZFb部分缺失+AZFd部分缺失,皆為聯合位點缺失,未檢出單獨的AZFc缺失,未發現AZFa缺失。在本組研究中,AZF缺失率為5.3%,與文獻綜合報道的1%-55%相比缺失偏低,這可能是由于:①精子發生是一個多階段的復雜過程,涉及與細胞分裂、分化和發育等過程有關的許多結構或功能基因,除Y染色體外有其它一些遺傳因素及未知生精調節基因異常;②不同地區、種族間可能存在差異;③可能還存在其他幾類缺失機制,目前尚未明確,需深入研究Y染色體微缺失的分子機制[4]。

研究表明,Y染色體微缺失是由于基因重所組造成,這與Y染色體上有大量高度重復和回文序列有關[5]。Y染色體微缺失和表型的關系如下:AZFa缺失不常見,與唯支持細胞綜合征(Scos)有關;AZFb缺失時精子發生常阻滯于精母細胞階段;AZFc缺失最常見,精子數目變化大,可從正常的精子數量至無精子[6]。Y染色體微缺失可以從正常的帶缺失的精子傳遞下來,也可以通過正常精子受精后在胚胎發育過程中發生Y染色體缺缺失,另外,現代人工輔助生育技術也可能將Y染色體微缺失遺傳下去,導致子代不育。由于AZFc缺失精子有進行性下降的趨勢,部分患者最后發展為無精子癥因此,對男性不育患者尤其是無精癥、少精癥患者進行AZF檢測,找到精子生成障礙的真正原因,具有非常重要的臨床意義。

[1]Hopps CV,Mielnik A,Goldstdein M,et al.Detection of spem in men with Y chromosome microdeletions of the AZFa.AZFb.and AZFc regions[J].Hum repord,2003,18(8):1660.

[2]Lanfranco F,Kamischke A,Zitzmann M,et al.Klinfelter's syndrome[J].Lancet,2004,364(9430):273.

[3]Dada R,Gupta NP,Kucheria K.J Yq microdeletions-azoosermia factor candidate genes and sper matogenic arrest[J].Biomol Tech,2004,15(3):176.

[4]劉祥印,薛百功,劉睿智,等.男性不育患者Y染色體AZF區微缺失分析[J].吉林大學學報(醫學版),2008,34(2):305.

[5]項云改,譚 麗.Y染色體微缺失與男性不育.國外醫學·計劃生育/生殖健康分冊,2007,26(1):5.

[6]崔英霞,李宏軍,黃宇烽.男性不育的遺傳學改變及可能對策[J].中華男科學,2003,9(6):462.