槲寄生藥材的高效液相指紋圖譜研究

于 淼， 徐海燕， 李 飛， 于治國， 趙云麗*

（1.沈陽藥科大學(xué)高職學(xué)院，遼寧沈陽 110026;2.沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧沈陽 110016）

本實驗為當(dāng)歸寄生注射液指紋圖譜［1］的研究工作的一部分。當(dāng)歸寄生注射液，由當(dāng)歸和槲寄生兩味藥材組成，具有舒筋活絡(luò)、祛風(fēng)濕、鎮(zhèn)痛之功效，用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肥大性脊椎炎、腰膝勞損、腰腿痛、痛經(jīng)、坐骨神經(jīng)痛、神經(jīng)性頭痛等證的治療。方中當(dāng)歸為血中圣藥，具有補血活血、化瘀止痛、生肌健骨之功效，槲寄生具有益肝腎、強筋骨、祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)益血之功效［2］。作者曾建立當(dāng)歸藥材的高效液相色譜指紋圖譜，為當(dāng)歸寄生注射液質(zhì)量控制提供依據(jù)［3］。近代化學(xué)成分和藥理研究表明，槲寄生主要化學(xué)成分有黃酮類、三萜類、苷類、甾醇類等多種化學(xué)成分，具有擴(kuò)張血管、鎮(zhèn)靜中樞等作用，同時有減少關(guān)節(jié)積液、改善關(guān)節(jié)骨端變性及骨質(zhì)疏松狀態(tài)、增寬狹窄的關(guān)節(jié)間隙等作用［4-5］。文獻(xiàn)報道，槲寄生藥材及其制劑的質(zhì)量控制方法主要是紫丁香苷和齊墩果酸的含量測定［6-7］。為全面地控制藥材質(zhì)量，本實驗對10個產(chǎn)地的槲寄生藥材進(jìn)行了指紋圖譜研究及聚類分析。

1 儀器與試藥

LC-10ATvp輸液泵、SPD-10Avp紫外檢測器（日本島津公司），ANASTA色譜工作站（美國 Suntek Science公司），PHS-2TC精密數(shù)顯酸度計（上海之信儀器有限公司），電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

阿魏酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，批號:0773-9910），乙腈、甲醇、四氫呋喃均為色譜純（天津市康科德科技有限公司），冰醋酸為分析純（天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心）。

槲寄生藥材（1-山東- 1;2-河北;3-山東-2;4-吉林;5-山東-3;6-山東泰安;7-遼寧鞍山;8-遼寧沈陽;9-山東五蓮縣;10-山西），由沈陽藥科大學(xué)孫啟時教授鑒定，粉碎過0.45 mm篩，置于干燥陰涼處備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性 色譜柱:Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相:以0.5%冰醋酸溶液（A）和甲醇-四氫呋喃（90∶10，v/v）（B）進(jìn)行梯度洗脫，程序為0～3 min，0%B;3 ～60 min，0%B ～40%B;檢測波長270 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:40℃;進(jìn)樣量:20 μL。理論塔板數(shù)以阿魏酸（20號峰）計不低于20 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取阿魏酸對照品約5.0 mg，加水制成每1 mL含50 μg阿魏酸的溶液。

2.2.2 供試品溶液 取槲寄生藥材5 g，加水75 mL煎煮2 h，濾過，濾渣加水50 mL煎煮2 h，合并濾液，減壓蒸餾至20 mL，加乙醇80 mL，靜置48 h，濾過，減壓蒸餾至15 mL，并定量稀釋至50 mL。將上述溶液與對照品溶液1∶1（v/v）混合后，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 儀器精密度試驗 取1號藥材粉末，按2.2項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果，各色譜峰相對保留時間RSD值為1.1% ～1.5%，相對峰面積RSD值為1.5%～2.9%。

2.4 方法重復(fù)性試驗 取1號藥材粉末，按2.2項下方法平行制備5份供試品溶液，分別測定，各色譜峰相對保留時間RSD值為1.3%～1.9%，相對峰面積RSD值為1.7%～3.0%。

2.5 穩(wěn)定性試驗 取1號藥材粉末，按2.2項下方法制備供試品溶液，室溫放置，分別于 0、2、4、8、10、24 h 進(jìn)樣分析，各色譜峰相對峰面積RSD值均為1.6% ～2.9%，表明供試品溶液室溫放置24 h穩(wěn)定。

2.6 槲寄生指紋圖譜的繪制及共有峰的確定 取不同產(chǎn)地槲寄生藥材10批，每批1份，按2.2項下方法分別制成供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣測定、記錄色譜圖。通過對比上述10個不同批次和產(chǎn)地的槲寄生藥材指紋圖譜，確定22個共有峰，其中20號峰為阿魏酸，將其作為參比峰。根據(jù)各色譜峰對參比峰的相對保留時間定性，各色譜峰相對參比峰的峰面積比值（X）定量。色譜圖見圖1（為5號樣品的色譜圖），相對峰面積結(jié)果見表1;各樣品出峰總數(shù)及其共有峰所占比例見表2。

表1 槲寄生藥材指紋圖譜共有峰相對峰面積

圖1 槲寄生高效液相指紋圖譜

表2 各樣品出峰總數(shù)及其共有峰所占比例

2.7 槲寄生藥材質(zhì)量評價方法的確立

2.7.1 系統(tǒng)聚類分析 本研究以經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定的10個不同產(chǎn)地和批次的槲寄生樣品為研究對象，進(jìn)行指紋圖譜研究，獲得包括阿魏酸（20號峰）在內(nèi)的22個色譜峰。將各色譜峰相對于參比峰的峰面積量化，得到10×22階原始數(shù)據(jù)矩陣，運用SPSS軟件對其進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，采用離差平方和法，利用歐氏距離作為樣品的測度。聚類分析將10個槲寄生樣品分為 2 類，其中 1、2、3、4、5、6、7、8、10 號樣品，列為

Ⅰ類，9號樣品列為Ⅱ類。聚類譜系圖見圖2。

圖2 槲寄生聚類譜系圖

2.7.2 相似度計算 結(jié)合聚類分析結(jié)果，從10個槲寄生藥材中，選取9號之外的其余9批藥材的指紋圖譜建立共有模式，采用夾角余弦、相關(guān)系數(shù)計算各樣品與共有模式之間的相似度。若樣品與共有模式間的夾角余弦和相關(guān)系數(shù)在0.80以上，則列為Ⅰ類;若低于0.80，則列為Ⅱ類。實驗結(jié)果表明，相似度分析結(jié)果與系統(tǒng)聚類結(jié)果一致，兩種方法得到了相互驗證。待測樣品獲取指紋圖譜數(shù)據(jù)后，計算其相似度即可評價其質(zhì)量。結(jié)果見表3。

表3 相似度檢驗結(jié)果

3 討論

當(dāng)歸寄生注射液高效液相色譜指紋圖譜研究已對供試品溶液制備方法及色譜系統(tǒng)進(jìn)行考察，因需進(jìn)行當(dāng)歸寄生注射液及組方藥味的相關(guān)性研究，本文采用相同的制備方法及色譜條件。

對比10批槲寄生藥材圖譜，山東五蓮縣槲寄生樣品的圖譜明顯不同，相似度明顯低于其它批。此外，山東五蓮縣槲寄生外觀不同于其他樣品，呈扁枝狀金黃色，而其它的槲寄生藥材呈圓枝狀棕黃色。根據(jù)扁枝槲寄生的外觀性狀的鑒別條件為莖基部圓柱形，具二棱，小枝扁平，綠色，每一節(jié)間呈矩圓狀倒披針形或近條形，上寬下狹，脈兩面具多條，葉退化成鱗片狀這些特點后經(jīng)孫啟時教授驗證其為扁枝槲寄生。

除9號樣品外，10號樣品的相似度也明顯低于其他幾批樣品，如果將相似度控制在0.90，那么10號樣品也會被單獨列為一類，所以在使用類似這樣的樣品時應(yīng)慎重考慮。

［1］于 淼，于治國，趙云麗，等.當(dāng)歸寄生注射液指紋圖譜研究［J］.中成藥，2004，26（8）:607-609.

［2］李正華，詹 奇，粱 篤.補骨方治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的療效觀察［J］.現(xiàn)代醫(yī)院，2004，14（4）:12.

［3］于 淼，李 飛，于治國，等.當(dāng)歸藥材中水溶性成分指紋圖譜的分析［J］.中國冶金工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2008，25（1）:20-22.

［4］趙 晶，賀江萍.槲寄生的化學(xué)成分及藥理作用研究［J］.天津中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2005，24（3）:185-186.

［5］王 俊，王國基，顏 輝，等.槲寄生的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］.時珍國醫(yī)國藥，2005，16（4）:300-303.

［6］徐建富，杜秀寶，孔景臨，等.RP-HPLC測定槲寄生中紫丁香苷的含量［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2004，11（2）:49-50.

［7］劉順航，王俊全，劉 巖，等.高效液相色譜法測定槲寄生中齊墩果酸的含量［J］.中成藥，2008，30（6）:926-928.