子宮內膜癌中抑癌基因PTEN突變與微衛星不穩定性的相關性分析

趙巖，劉巋然，張淑蘭

（中國醫科大學 附屬盛京醫院婦產科，沈陽 110004）

子宮內膜癌占女性生殖道惡性腫瘤的20%~30%，近年又有上升的趨勢，已接近甚至超過宮頸癌的發病率。探討內膜癌發生、發展的分子生物學特征及其臨床病理學意義，可為臨床醫生對內膜癌的早期診斷、臨床處理提供依據。子宮內膜癌中最常見的分子水平改變為：微衛星不穩定性（microsatellite instability，MSI）和抑癌基因——第10染色體同源丟失性磷酸酶-張力蛋白基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）突變。本研究通過對PTEN第5，第8外顯子突變的檢測及序列分析與MSI進行相關性分析，旨在找到正常子宮內膜癌變的可能途徑。

1 材料與方法

1.1 材料來源

組織標本取自2002-2004年在盛京醫院接受手術治療的患者。子宮內膜癌40例，內膜癌患者均無遺傳性非息肉性結直腸癌（hereditary nonpolyposis colon cancer，HNPCC）家族史。 年齡 41～75 歲，平均年齡56.40歲。選擇同期住院手術的子宮內膜不典型增生患者22例，23例因子宮肌瘤手術患者的正常子宮內膜標本做對照。所有患者術前均未接受放、化療和激素治療。

1.2 實驗試劑

飽和酚、氯仿、異戊醇為國產試劑。

PCR反應體系、電泳緩沖體系、丙烯酰胺、N，N-甲叉雙丙烯酰胺、TEMED、過硫酸銨等試劑購于SIGMA公司。

引物：PTEN基因外顯子5（正向引物：5′-CTTATTCTGAGGTTATCTTTTTTACC-3′；反向引物：5′-CTCAGATCCAGGAAGAGGA-3′，228 bp）；PTEN 基因外顯子 8（正向引物：5′-AGGACAAAATGTTTCACTTT TGGG-3′；反向引物：5′-ACATACATACAAGTCACCAACCC-3′，257 bp）：由北京三博遠志生物技術有限責任公司合成。

1.3 方法

1.3.1 PCR-SSCP進行PTEN基因外顯子5和8的突變檢測：

（1）提取新鮮冷凍組織及石蠟包埋組織塊DNA

（2）PCR擴增：PCR反應體系為30μl。95℃預變性 5 min→94℃30 s→57℃30 s→72℃1 min，共35個循環。72℃延伸5 min。

（3）電泳：取PCR擴增產物3μl與變性劑1∶5混勻，于98℃水浴變性10 min后迅速置于冰浴5 min。取15μl進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。

（4）銀染顯色：存入1Dkodak成像分析系統。

（5）將出現異常條帶的DNA擴增產物送上海Invitrogen生物技術有限公司測序。

1.3.2 微衛星不穩定性（MSI）的檢測：.

（1）DNA的提取：步驟同前。

（2）微衛星位點的選擇：選取D13S175，D10S197，D2S123，D10S215，D10s541，共 5 個位點。

（3）微衛星PCR的擴增和電泳：采用銀染法顯色，保存圖像。癌組織和同一患者的正常組織DNA在同一條件下電泳，若出現完全一致的電泳條帶，則MSI陰性；如果二者比較出現條帶的移動、缺失或獲得額外的條帶，為MSI陽性。

1.4 統計學方法

采用SPSS12.0進行χ2檢驗比較組間的差異和相關分析，P<0.05為有顯著性統計學差異。

2 結果

2.1 抑癌基因PTEN在正常子宮內膜（normal epithelium，NE）、子宮內膜不典型增生（atypical endometrial hyperplasia，AH）、子宮內膜癌（endometrial carcinoma of uterus，UEC）中的突變

23例正常子宮內膜（NE）中無PTEN突變發生；22例子宮內膜非典型增生中（AH）7例（31.8%）發生突變；40例子宮內膜癌中11例（27.5%）發生抑癌基因PTEN的突變，3組之間差異有顯著性（χ2=8.630，P<0.05）。NE和AH兩組相比差異有顯著性（χ2=8.666，P<0.01）；UEC和 AH 兩組相比差異無顯著性（χ2=0.128，P>0.05）。PTEN 外顯子PCR產物見圖1，PCR-SSCP 結果見圖 2。

2.2 子宮內膜癌臨床病理參數與PTEN基因突變的關系

如表1所示，PTEN基因突變與子宮內膜癌的手術病理分期有關（χ2=5.030，P<0.05），在子宮內膜癌中PTEN的突變更傾向于發生在手術分期較晚的病例中。PTEN的突變多發生在病理分化程度較高的子宮內膜樣腺癌中。（36例子宮內膜樣腺癌中11例發生PTEN突變；4例非子宮內膜樣腺癌中發生PTEN突變的為0）。

2.3 抑癌基因PTEN突變的DNA測序

在發生PTEN突變的18例病例中，大多數為堿基的插入和缺失造成的移碼突變。在子宮內膜癌中發現2例PTEN突變發生在外顯子8的poly（A）區域，所有標本均未見外顯子5和8同時發生突變。

2.4 子宮內膜病變中MSI的分析

子宮內膜不典型增生、子宮內膜癌中MSI發生的頻率逐漸升高（2/22，9.09%；8/40，20%），與正常子宮內膜組比較，差異有統計學意義（χ2=5.26，P<0.05）。本研究中所有MSI陽性病例均重復1遍實驗，以避免因聚合錯誤引起的MSI假陽性。發生在子宮內膜不典型增生組中的2例MSI均為病理證實的局灶惡變。5個微衛星位點出現MSI的頻率有所不同。其中出現MSI較多的位點是D2S123和D13S175，各有9例在這兩個位點發生MSI；出現MSI頻率最低的位點為D10S215，僅1例發生MSI。

表1 子宮內膜癌臨床病理參數與PTEN基因突變的關系Tab.1 Relationship between PTEN mutations and the clinicopathologicalcharacteristics of UEC

2.5 子宮內膜癌中抑癌基因PTEN突變與MSI的狀態

子宮內膜癌中11例PTEN突變陽性，其中MSI陽性的7例，MSI陰性的4例；8例MSI陽性的內膜癌中，PTEN突變陽性的7例，PTEN突變陰性的1例。二者高度相關（χ2=18.06，P<0.01）。

3 討論

3.1 子宮內膜癌與抑癌基因PTEN

子宮內膜癌是常見的女性生殖道惡性腫瘤，其發病率逐年上升，嚴重威脅婦女健康。被大多數學者認同的是將子宮內膜癌分為兩型：Ⅰ型為子宮內膜樣的子宮內膜癌（EEC），屬于雌激素依賴型，占85%，較多見；Ⅱ型為非子宮內膜樣子宮內膜癌（NEEC），屬于非雌激素依賴型，占15%。其中，Ⅰ型子宮內膜癌中最常見的分子水平改變為：微衛星不穩定性和抑癌基因PTEN突變。

PTEN是1997年發現的一個抑癌基因，在許多腫瘤中均存在突變，子宮內膜癌中PTEN突變率為24.5%~55%［1］，是迄今為止發生突變率最高的腫瘤。PTEN因此被認為是子宮內膜癌的看家基因，人們已經意識到PTEN基因在內膜癌的發生過程中起重要作用，但是其在子宮內膜癌變過程中所起的具體作用及PTEN表達調控機制并不清楚。

Yaginuma等［2］發現 PTEN 的外顯子 5，8占突變率60%。PTEN突變方式主要有移碼突變、無義突變、缺失、拼接體突變等。已有的研究表明移碼突變占總突變率的57%［3］。子宮內膜不典型增生中PTEN突變率為20%~33%［4］。本研究中，PTEN的突變從NE，AH到UEC表達差異有顯著性（P<0.05），值得注意的是，在內膜癌癌前病變——子宮內膜不典型增生中，PTEN突變已經有了顯著性的改變，同PTEN蛋白表達的結果一致［5］。在轉錄水平和蛋白水平上，內膜癌和其癌前病變中PTEN的表達和突變均明顯不同于正常子宮內膜，說明PTEN的改變發生在侵襲癌之前，PTEN失活可以發生在內膜癌變的早期，PTEN功能受損可能影響AH的發展和（或）促進AH向UEC的發展。本研究只檢測了PTEN外顯子5、8，有可能不能全面分析所有子宮內膜不典型增生中PTEN的突變情況。

關于內膜癌臨床病理參數與PTEN突變之間關系的報道結果不一。本研究發現PTEN基因突變與子宮內膜癌的手術病理分期有關（P<0.05），在子宮內膜癌中PTEN的突變更傾向于發生在手術分期較晚的病例中。PTEN的突變多發生在病理分化程度較高的子宮內膜樣腺癌中（36例子宮內膜樣腺癌中11例發生PTEN突變；4例非子宮內膜樣腺癌中發生PTEN突變的為0），說明抑癌基因PTEN功能喪失多發生在I型子宮內膜癌中，是該類內膜癌中重要的分子事件。

3.2 子宮內膜癌中PTEN突變與微衛星不穩定性之間的關系

抑癌基因PTEN突變和微衛星不穩定性（MSI）是I型子宮內膜癌中最常見的兩種分子水平的改變。在HNPCC綜合征中MSI陽性的病例PTEN突變率高于MSI陰性的病例，認為二者可能存在相關性。那么，在散發性子宮內膜癌中是否也存在這種相關性，它的分子基礎是什么還并不清楚。Wang［6］等在動物實驗中發現，伴有PTEN突變的內膜不典型增生小鼠如果合并hMLH1突變很快會發生浸潤癌，錯配修復基因hMLH1可以促進子宮內膜癌變。

本實驗中發現在微衛星不穩定性陽性的內膜癌中發生PTEN突變率高于微衛星不穩定性陰性的內膜癌（87.5%，12.5%，P<0.05）。驗證了在I型子宮內膜癌中最常見的兩種分子水平的改變——微衛星不穩定性與PTEN突變密切相關的假說。而MSI陽性的散發性子宮內膜癌中MSI的狀態與hMLH1的失表達有關［7］。

微衛星DNA重復序列廣泛的存在于人類基因組中，如果微衛星影響了某些基因的編碼區，它就會導致基因功能的喪失并促進癌變。在本研究發生突變的病例中，有2例DNA測序發現PTEN突變發生在PTEN外顯子8的poly（A）區域，可能是錯配修復基因功能受損的結果。子宮內膜癌中繼發于錯配修復基因hMLH1缺失所導致的微衛星不穩定性陽性可以增加PTEN核苷酸重復序列的突變，導致基因失活可能是子宮內膜癌發生的一個途徑。其他基因也有類似的報道，在MSI陽性的腫瘤中，經常發生編碼重復單核苷酸微衛星序列的突變。如：BAX基因的 poly（G）區域、TEF-beta RII的 poly（A）區域等，這些移碼突變被看成是MSI陽性腫瘤形成的多步驟過程的繼發事件。因此，PTEN基因Poly（A）區域的突變可以認為是錯配修復功能受損后的繼發反應，可以促進微衛星突變子顯型的發展，這樣也就能解釋為什么在MSI陽性的子宮內膜癌中，發生PTEN基因的突變率高于MSI陰性的腫瘤。

PTEN突變和微衛星不穩定性是I型子宮內膜癌中重要的分子事件，二者在內膜癌中高度相關。可能存在繼發于錯配修復基因hMLH1缺失所導致的微衛星不穩定性增加PTEN核苷酸重復序列突變的致癌途徑。PTEN突變是內膜癌變過程中的早期事件，可能促進子宮內膜不典型增生向子宮內膜癌的發展。

［1］Tantbirojn P，Triratanachat S，Trivijitsilp P，et al.Detection of PTEN immunoreactivity in endometrial hyperplasia and adenocarcinoma［J］.JMed Assoc Thai，2008，91（8）：1161-1165.

［2］Yangiuma Y，Yamashita T，Ishiya T，et al.Abnormal structure and expression of PTEN/MMAC1 gene in human uterine cancers［J］.Mol Carcinog，2000，27（2）：110-116.

［3］Dellas A，Jundt G，Sartorius G，et al.Combined PTEN and p27kip1 protein expression patterns are associated with obesity and prognosis in endometrial carcinomas［J］.Clin Cancer Res，2009，15（7）：2456-2462.

［4］Norimatsu Y，Miyamoto M，Kobayashi TK，et al.Diagnostic utility of phosphatase and tensin homolog，beta-catenin，and p53 for endometrial carcinoma by thin-layer endometrial preparations［J］.Cancer，2008，114（3）：155-164.

［5］趙巖，銀鐸，張淑蘭，等.抑癌基因PTEN與錯配修復基因hMLH1在子宮內膜癌中的表達及意義［J］.中國實用婦科與產科雜志，2006，22（6）：427-430.

［6］Wang H，Douglas W，Lia M，et al.DNA mismatch repair deficiency accelerates endometrial tumorigenesis in PTEN heterozygous mice［J］.Am JPathol，2002，160（4）：1481-1486.

［7］趙巖，張淑蘭，楊清.散發性子宮內膜癌中錯配修復基因hMLH1表達與微衛星不穩定性的相關性分析［J］.中華腫瘤防治雜志，2007，14（10）：772-775.