聯合應用全反式維甲酸與單純皰疹病毒腺苷激酶基因對髓母細胞瘤的協同殺傷作用研究

蒲珂，李少一，馬麗，高蕓，劉云會

（1.中國醫科大學 附屬盛京醫院神經外科，沈陽 110004；2.上海交通大學 醫學院附屬第九人民醫院口腔醫學院，上海 200011；3.中國醫科大學 附屬第一醫院內分泌研究所，沈陽 110001）

髓母細胞瘤（medulloblastoma，MB）是惡性程度極高的兒童后顱窩腫瘤，呈浸潤性生長，易播散轉移，手術難以完全切除，預后極差［1］。基因治療為顱內惡性腫瘤的治愈帶來了希望，其中研究最廣泛、最有希望的是單純皰疹病毒腺苷激酶/更昔洛韋（herpes simplex virus-thymidine kinase/ganciclovir，HSV-tk/GCV）自殺基因系統。HSV-tk/GCV系統抗腫瘤作用的原理是在腫瘤細胞中導入腺苷激酶（thymidine kinase，TK）基因，TK基因表達的腺苷激酶可以將無毒的更昔洛韋（ganciclovir，GCV）在腫瘤局部轉化為有毒的三磷酸更昔洛韋，從而發揮高效的抗腫瘤作用。該自殺基因系統毒副作用小，抗腫瘤效果強，受到了廣泛關注。

TK基因介導的自殺基因治療中還存在一種機制——“旁觀者效應”：當給予更昔洛韋時，導入TK基因的“陽性細胞”周邊的未導入TK基因的“陰性細胞”也會被一同殺死的現象。在“旁觀者效應”存在的情況下，TK基因對腫瘤細胞的殺傷作用進一步增強。在我們以前的研究中，應用HSV-tk/GCV自殺基因系統對膠質瘤細胞系進行了較系統的研究，并且應用神經干細胞攜帶TK基因，對該治療系統進行了優化，獲得了很好的治療效果［2~5］。而在好發于兒童的髓母細胞瘤中應用HSV-tk/GCV自殺基因系統的研究還未見報道。本研究聯合應用全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）與 HSV-tk/GCV 系統，研究二者聯合應用對人的髓母細胞瘤細胞系Daoy的殺傷作用，旨在探討在髓母細胞瘤細胞系中應用HSV-tk/GCV自殺基因治療可行性，并且針對ATRA對該系統中“旁觀者效應”的影響進行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及細胞株

ATRA、噻唑藍（MTT）、G418、二甲基亞楓（DMSO）均購自Sigma公司，Polybrene購自Aldrich公司。Daoy髓母細胞瘤細胞系購自美國ATCC公司。產生復制缺陷型HSVtk逆轉錄病毒的PA317包裝細胞由Genetic Therapy公司提供。

1.2 ATRA對Daoy細胞生長抑制作用的測定

取對數生長期的Daoy細胞，以2×103/孔接種于96孔板，待細胞貼壁后加不同濃度的ATRA（0~1 μmol/L），每個濃度設3個復孔，每天換液1次，3 d后MTT法測細胞存活率。

1.3 Daoy細胞的轉染及篩選

取對數生長期的Daoy細胞，以50%~60%細胞密度鋪于6孔板，4~6 h后更換為加入1 ml HSV-tk逆轉錄病毒上清和8μg/ml的Polybrene的培養液，繼續培養24 h后更換為正常培養液，繼續培養12 h。將轉染后細胞轉移至24孔板，加200μg/ml G418篩選，每3 d換液1次，篩選12 h，選取有G418抗性的細胞在以后的實驗中應用。

1.4 Daoy-tk細胞對GCV敏感性測定

對照組：正常Daoy細胞；實驗組：Daoy-tk細胞。分別取對數生長期的兩種細胞以2×103/孔密度接種于96孔板，細胞貼壁后，加不同濃度梯度的GCV（0~30μg/ml），每個濃度設3個復孔，條件培養液每2 d更換1次。第7天MTT法測細胞生存率：每孔加入5μg/ml的MTT 20μl，37℃孵育4 h，棄培養液，加入DMSO 150μl，在酶聯免疫檢測儀上以492 nm波長檢測各孔吸光光度值（A）。細胞存活率=實驗組A均值/對照組A均值×100%。

1.5 在不同濃度GCV存在下，Daoy-tk細胞通過“旁觀者效應”對Daoy細胞的殺傷作用

對照組：單獨Daoy細胞；治療組：Daoy-tk與Daoy 1∶1比例混合，以4×103/孔的細胞密度接種于96 孔板，加不同濃度的 GCV（0~30 μg/ml），每個濃度設3個復孔，條件培養液2 d更換1次。7 d后MTT法測細胞生存率。

1.6 Daoy-tk聯合ATRA對Daoy細胞殺傷作用的觀察

（1）對照組：單獨 Daoy細胞；（2）Daoy-tk單獨治療組：Daoy-tk與Daoy細胞按不同比例（1∶1~1∶16）混合；（3）Daoy-tk 與 ATRA 聯合治療組：Daoy-tk與Daoy細胞按不同比例（1∶1~1∶16）混合。以上3組均以4×103/孔的細胞密度接種于96孔板，每種細胞比例設3個復孔，對照組和Daoy-tk單獨治療組加3μg/ml GCV，Daoy-tk與ATRA聯合治療組加3 μg/ml GCV和1μmol/L的ATRA。2 d換液1次，7 d后MTT法測細胞生存率。

1.7 統計學分析

實驗數據應用SPSS12.0統計，以x±s表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ATRA對Daoy細胞生長的抑制作用

不同濃度的ATRA對Daoy細胞作用3 d后，MTT結果表明：在0.5~1μmol/L區間范圍內，ATRA即可對Daoy細胞的生長產生明顯抑制作用，并且隨ATRA濃度的增加，抑制作用逐漸增強。當ATRA濃度為0.5μmol/L時，Daoy細胞的存活率約為90.13%；ATRA濃度為1μmol/L時，Daoy細胞的存活率為79.13%，與ATRA濃度為0μmol/L時的對照組相比存在統計學差異（P＜0.05）。見圖1。

2.2 Daoy-tk對GCV的敏感性

Daoy細胞與轉染后的Daoy-tk細胞分別加入不同濃度的GCV，7 d后MTT結果顯示：Daoy-tk細胞在GCV濃度為0.1μg/ml時出現大量死亡，3μg/ml時達到最大殺傷作用，而未轉染的Daoy細胞在GCV濃度為30μg/ml時才出現明顯死亡，兩組差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

2.3 在不同濃度GCV存在下，Daoy-tk細胞通過“旁觀者效應”對Daoy細胞殺傷作用

為了觀察不同濃度GCV作用下，Daoy-tk細胞通過“旁觀者效應”對Daoy細胞的殺傷作用及確定GCV的最低有效劑量，在Daoy與Daoy-tk混合細胞中加入不同濃度的GCV，7 d后MTT結果顯示：GCV在3μg/ml濃度時即對Daoy產生最大殺傷作用，此時Daoy細胞的存活率為57.69%。繼續加大GCV濃度，不能增強其抗腫瘤效果。見圖3。

2.4 聯合應用ATRA與Daoy-tk對Daoy細胞殺傷作用

Daoy-tk與Daoy細胞按不同比例混合，加入3 μg/ml的GCV后，對Daoy細胞產生明顯的殺傷作用，并且隨Daoy-tk細胞比例的增加，殺傷作用逐漸增強，Daoy-tk∶Daoy=1∶4時，Daoy細胞存活率為89.23%；聯合應用1μmol/l的ATRA后，明顯增強對Daoy細胞的殺傷作用，Daoy-tk∶Daoy=1∶16時，仍有明顯的殺傷作用，Daoy細胞存活率為89.7%。見圖4。

3 討論

自殺基因療法是基因治療中研究最廣泛、最有希望的治療方法，在體內外實驗中，對多種腫瘤細胞系均具有很強的殺傷作用。但臨床實驗中抗腫瘤效果并不讓人滿意［6］，除了病毒載體的轉染效率低之外，“旁觀者效應”作用低下也是重要原因。“旁觀者效應”的發揮依賴于細胞間縫隙連接通訊（gap junctional intercellular communicatisn，GJIC）的建立，惡性腫瘤細胞具有浸潤性生長、易播散轉移的特性，GJIC的建立相對較少［7］。如何增強“旁觀者效應”，成為目前自殺基因治療需要攻克的重要課題。在我們以前的研究中，應用神經干細胞攜帶TK基因，利用神經干細胞對膠質瘤細胞的主動運動的趨化能力，將TK基因盡可能攜帶到腫瘤細胞周圍，產生更大的“旁觀者效應”，獲得了非常好的治療效果［4］，但針對“旁觀者效應”機制方面加強TK基因抗腫瘤效果的研究報道很少，這方面的工作必將為HSV-tk/GCV自殺基因治療系統取得更好的臨床療效提供有益補充。

ATRA是維生素A的重要衍生物，臨床已廣泛應用于血液系統腫瘤的治療，其自身即可以誘導腫瘤細胞分化與凋亡。本研究發現ATRA在極低濃度下（0.5~1μmol/L）即可對髓母細胞瘤細胞系Daoy的生長產生明顯抑制作用。而有報道ATRA在1~10 μmol/L濃度范圍內才可對膠質瘤C6細胞的生長產生抑制作用［8］，可見Daoy細胞系對ATRA的敏感性更高。

ATRA除了自身對腫瘤細胞的抑制作用外，還可以上調腫瘤細胞間GJIC的表達。張雪峰等研究表明，ATRA能提高膠質瘤C6細胞系中Cx43的表達，ATRA提高Cx43表達后能進一步增強HSV-tk/GCV系統對膠質瘤的殺傷作用［9］。Chen 等［10］研究表明，聯合應用ATRA能增強HSV-tk/GCV系統對前列腺癌細胞的殺傷作用。本實驗中我們證實，tk細胞與Daoy細胞比例為1∶4時，對腫瘤細胞生長有明顯的抑制作用。聯合應用ATRA時即使tk細胞與腫瘤細胞比例低至1∶16時仍有明顯的腫瘤抑制作用，并且同等細胞比例條件下，聯合治療組對腫瘤細胞殺傷作用更強。作為脂溶性藥物，ATRA可以自由通過血腦屏障在腦內儲集，是聯合HSV-tk/GCV系統治療顱內惡性腫瘤的理想用藥。

綜上所述，ATRA與HSV-tk/GCV系統聯合應用，對人的髓母細胞瘤細胞系Daoy的殺傷具有協同作用。聯合應用兩種臨床安全性都已得到證實的治療方案，必定使顱內惡性腫瘤的治療具有廣闊的前景。

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