sRAGE胞外段—IgGFc融合蛋白對大鼠糖尿病腎病的作用

張 璟,莫桂玲,蘇志堅,許 華,鄭 青*

(1暨南大學藥學院,廣州 510632；2暨南大學生命與健康工程研究院)

晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)是糖尿病腎病(DN)發(fā)病機制中的一個重要因素,在糖尿病(DM)高糖環(huán)境下,體內(nèi) AGEs明顯增加,與 DM慢性并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。研究表明,AGEs形成和堆積與 DN有密切關(guān)系[1]。可溶性 AGEs受體(sRAGE)無胞內(nèi)段部分,可與細胞膜上的 RAGE競爭性結(jié)合 AGEs,從而阻斷 AGEs與 RAGE的相互作用,抑制由RAGE誘導(dǎo)的細胞信號傳導(dǎo)途徑,為防治 DM并發(fā)癥提供了新的治療途徑[2]。IgG型免疫球蛋白是人類血液中最豐富的蛋白質(zhì),將人 IgG的 Fc區(qū)與其他目的蛋白質(zhì)結(jié)合形成融合蛋白,延長目的蛋白質(zhì)的半衰期已有報道[3]。由于結(jié)構(gòu)上的同源,Fc融合蛋白具有的體外藥物代謝動力學特性與同類型的人IgG相當,因此,目前已有一些 Fc融合蛋白藥物(如治療類風濕性關(guān)節(jié)炎的藥物)應(yīng)用于臨床。2008～2009年,我們觀察了 sRAGE-IgGFc融合蛋白對 DM大鼠的腎臟保護作用。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型 清潔級雌性 SD大鼠 60只,體質(zhì)量(180±25)g,由廣東省實驗動物中心提供。將其隨機分為正常對照組、DN組、洛汀新組(1.5 mg/kg)、sRAGE-IgG Fc 4 mg/kg組(L組)、sRAGE-IgGFc 6 mg/kg組(M組)、sRAGE-IgG Fc 9 mg/kg組(H組)各 10只。洛汀新組為灌胃給藥,其余各組腹腔注射給藥,均 1次/d,共 4周。各組普通飲食飼養(yǎng) 1周后,在戊巴比妥鈉麻醉下,摘除左腎。術(shù)后 1周對 DN組予以高糖、高脂飲食。

1.2 DM模型制備 高糖、高脂飲食 1個月后,DN組一次腹腔注射鏈脲佐菌素 30 mg/kg。正常對照組注射等量檸檬酸鈉—檸檬酸緩沖液。1周后檢測其非空腹血糖(FPG)及胰島素(INS),FPG≥16.7 mmol/L伴胰島素敏感性降低為 DM建模成功。DM建模成功后,DN組繼續(xù)普通飲食 2個月。

1.3 檢測方法 ①FPG、INS檢測:采用美國 Lifescan穩(wěn)步血糖儀和試紙條檢測 FPG；放免法、北京原子高科核技術(shù)應(yīng)用公司產(chǎn)免疫活性胰島素放免試劑盒檢測 INS。②血壓、血脂檢測:采用 RBP-1大鼠尾血壓測定儀檢測血壓；酶法檢測血脂。③腎臟生化指標檢測:實驗結(jié)束前 1 d,用代謝籠收集各組 24 h尿液,用免疫散濁法檢測尿蛋白和尿肌酐。次日用戊巴比妥鈉麻醉大鼠,從其心臟采血,檢測血肌酐(Scr)、血尿素氮 (BUN)、尿體積 (Urine volume)、尿白蛋白排泄率(UAER),計算內(nèi)生肌酐清除率(Ccr)。④腎組織病理學檢測:處死大鼠取其右腎,用中性甲醛固定,乙醇逐級脫水,石蠟包埋切片,常規(guī) HE染色,樹膠固封；在光鏡下(400×)觀察各組腎組織變化。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件,數(shù)據(jù)以±s表示,組間比較用 t檢驗。 P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組 FPG、INS比較 見表1。

表1 各組 FPG及 INS比較(±s)

表1 各組 FPG及 INS比較(±s)

注:與正常對照組比較,*P＜0.01

組別 n FPG(mmol/L) INS(mIU/L)正常對照組 10 5.73±0.30 20.80±1.32 DN組 10 30.38±3.36* 12.62±1.69*洛汀新組 10 29.24±3.21* 12.34±2.04*L組 10 30.80±3.07* 11.87±0.98*M組 10 30.19±3.08* 12.08±0.97*H組 10 29.96±3.31* 12.25±1.47*

2.2 各組血壓、血脂比較 見表2。

表2 各組血壓、血脂比較(±s)

表2 各組血壓、血脂比較(±s)

注:與正常對照組比較,*P＜0.01；與 DN組比較,△P＜0.01

組別 n BP(kPa) TG(mmol/L)TC(mmol/L)正常對照組 10 13.37±1.21 0.73±0.12 1.19±0.13 DN組 10 21.18±1.90* 2.23±0.17*4.38±0.27*洛汀新組 10 16.76±1.36*△ 2.15±0.15*4.26±0.21*L組 10 19.25±1.40* 2.20±0.20*4.30±0.24*M組 10 17.92±1.27*△ 2.18±0.18*4.24±0.25*H組 10 17.28±1.34*△ 2.15±0.18*4.25±0.26*

2.3 各組腎臟生化指標比較 見表3。

表3 各組腎臟生化指標比較(±s)

表3 各組腎臟生化指標比較(±s)

注:與正常對照組比較,*P＜0.01；與DN組比較,△P＜0.01

組別 n BUN(mmol/L) Scr(μmol/L) Ccr(ml/min) Urine volume(ml) UAER(mg/24 h)正常對照組 10 6.91±0.45 60.59±6.66 0.65±0.07 25.12±2.37 3.25±0.47 DN組 10 18.42±1.06* 125.59±12.16* 1.70±0.11* 97.29±6.26* 12.53±2.43*洛汀新組 10 9.22±0.57 71.23±3.52△ 1.22±0.15△ 55.53±4.02*△ 7.37±1.11*△L組 10 12.59±0.62* 89.54±4.12△ 1.39±0.06△ 96.24±3.27 9.01±0.69*△M組 10 11.21±0.56* 79.49±4.13△ 1.31±0.17△ 91.52±1.17 8.13±0.62*△H組 10 9.22±0.35△ 70.89±5.31△ 1.22±0.14△ 93.47±2.29 7.39±0.69*△

2.4 各組光鏡下腎臟病理變化 正常對照組腎組織無病理改變。DN組腎小球體積明顯增大,細胞數(shù)量增多,可見炎細胞浸潤；部分腎小球系膜細胞增生,毛細血管基底膜呈彌漫性增厚,系膜基質(zhì)增寬；部分腎小管發(fā)生輕度萎縮或管腔擴張,上皮細胞水腫,空泡變性明顯,間質(zhì)可見炎性細胞浸潤和纖維增生。洛汀新組、L組、M組、H組腎臟病變不同程度地減輕,部分腎小球增大、腎小球系膜細胞增生等減輕,以 H組作用明顯。

3 討論

近年來,sRAGE作為 RAGE拮抗劑是治療 DN的一條新途徑。正常情況下,血漿中存在微量sRAGE,長期給藥不會引起人體免疫效應(yīng)[4]。我們將 IgG的 Fc段接在 sRAGE后構(gòu)建 sRAGE-IgG Fc融合蛋白,希望能延長其半衰期,并賦予其一定的靶向。本研究顯示,與正常對照組比較,DN組血糖、血脂降低無統(tǒng)計學差異,可能與 sRAGE-IgGFc融合蛋白不能對胰島形成顯著的保護有關(guān)。DN組BUN、Scr、Ccr、UAER及血壓均明顯高于正常對照組,而給予 sRAGE-IgGFc融合蛋白的 L、M、H組上述指標均不同程度地降低,且光鏡下可見腎小球增大及腎小球系膜細胞增生等改變減輕。其可能原因是在血管和腎組織中,sRAGE-IgG Fc融合蛋白與AGEs結(jié)合并阻止了 AGEs-RAGE的相互作用,從而起到腎臟保護作用。

[1]Raptis AE,Viberti G.Pathogenesis of diabetic nephropathy[J].Exp Clin Endocr Diab,2001,109(2):424-437.

[2]Angeliga B,Per M,Humper T,et al.Understanding RAGE,the receptor for advanced glycation end products[J].J Mol Med,2005,83(11):876-886.

[3]Capon DJ,Chamow SM,Mordenti J,et al.Designing CD4immunoadhesinsfor AIDS therapy[J].Nature,1989,337(6207):525-531.

[4]劉華.晚期糖基化終末產(chǎn)物及其受體與糖尿病腎病[J].國外醫(yī)學:泌尿系統(tǒng)疾病分冊,2005,25(4):658-660.