特發性矮小患兒 Shox基因突變及多態性分析

謝蓉蓉,陳臨琪,李桂梅

(1蘇州大學附屬兒童醫院,江蘇蘇州 215003；2山東大學附屬省立醫院)

人體身高由多基因決定,研究顯示,兒童身材矮小發生率約 3%,大多數原因未明[1],在促進身高生長中起關鍵作用的矮小同源盒(Shox)基因異常與Leri-Weill軟骨骨生成障礙(LWD)、Turner綜合征及(TS)、特發性矮小(ISS)等有關。為了解 Shox基因突變在山東地區矮小兒童中的發生情況,2006年 10月 ～2007年 3月,我們對 25例 ISS患兒進行了 Shox基因突變及多態性研究。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇在山東大學附屬省立醫院就診的 ISS患兒 25例,男 18例、女 7例,年齡 5～15歲。患兒身高低于同種族、同性別正常人群均值-2s或低于第三百分位數。排除生長激素缺乏癥、甲狀腺功能低下、營養不良、垂體腫瘤、TS所致的矮小,其生長激素正常或增高,胰島素樣生長因子 1和胰島素樣生長因子結合蛋白 3正常或低下,骨齡落后；均有以下 1項或 1項以上骨骼異常:前臂中部和小腿短小、短掌骨、曲腕畸形、提攜角增大、肘外翻。

1.2 檢測方法

1.2.1 DNA提取和 PCR擴增 取受檢者外周抗凝血 3 ml,采用酚—氯仿抽提方法提取外周血基因組DNA,離心后取上清液,-80℃保存備用。采用常規 PCR擴增,PCR反應總體積 49μl,其中含 Taq DNA聚合酶 1.0μl、10×反應緩沖液,進行 32個循環。PCR產物用 1.5%瓊脂糖凝膠檢測,每個樣品進行 32次 PCR反應,分別擴增 Shox基因外顯子,引物設計參考文獻[2,3],引物序列見表1。

1.2.2 DNA序列分析 采用 PCR產物直接測序方法、北京博亞公司產 ABI377全自動序列分析儀分析樣品純化及序列。對正向測序異常標本進行反向測序,予以確證,測序結果與 GENEBANK進行比較。

表1 Shox基因的引物序列

2 結果

本組 ISS患兒未發現 Shox基因突變。經 DNA直接測序,發現 1例患兒 Shox基因序列改變,堿基7 448 T＞G(rs 2239402),位于內含子區域,與 Haga等[4]報道的 Shox基因多態性結果相符。

3 討論

Shox基因克隆定位于 X和 Y染色體短臂末端(Xp22.32或 Yp11.3)偽常染色體區域(PAR1),全長 40 kb；其中完全編碼序列 879 bp,由 7個外顯子組成,大小 58～1 166 bp,為成對相關的同源盒基因家族成員,其在種屬間具有高度保守性。Shox基因在人骨源性組織中高度表達,自胚胎第 8周開始Shox mRNA在原始骨表達,胚胎 12周起 Shox蛋白在生長板的儲備區、增生區和肥大區(主要是肥大/凋亡的軟骨細胞上)廣泛表達。有學者推測,雙拷貝 Shox基因表達可能具有潛在抑制雌激素對肢骨中遠端的負性生長作用(抑制骨骼生長,促進骨骼成熟),提示 Shox基因功能似乎與骨骼線性生長的啟動子和骨骺融合的抑制子有關[5]。Shox基因逃避 X染色體失活,其基因突變或缺陷致相關蛋白表達量不足可導致軟骨細胞增殖、分化紊亂,失去生長板增殖層和終末期細胞凋亡間的平衡；喪失抑制雌激素對生長板的負性生長作用,從而影響最終身高；患兒可伴有肢中部短小、掌骨短、屈腕畸形、提攜角增大等肢骨畸形,這些骨畸形可見于 TS、LWD和Langer綜合征、ISS。據報道[6],用熒光原位雜交技術和直接測序法檢測 ISS患兒的 Shox基因,發現其突變發生率為 2.0%～12.5%。

Schneider等[7]發現,在 ISS和 LWD患者中,Shox基因突變通過引發 DNA結合丟失、二聚化能力降低和核轉運能力損傷導致其生物功能改變。此外,點突變(c458 G＞T,p R153L)盡管不影響 Shox基因 DNA結合、二聚化能力和核轉錄,但能影響其轉錄激活能力,改變生物功能。因此認為,錯義突變能損害 Shox基因關鍵功能,導致身材矮小表型[8]。

本研究檢測到 1例 ISS患兒 Shox基因序列改變,其改變與 Haga等[4]報道的 Shox基因多態性結果相符。單核苷酸多態性是指由單個核苷酸替代、插入或缺失形成的分子多態,其中最少的一種在人群中的出現頻率不小于 1%。由此推測,Shox基因突變可能不是山東地區 ISS患兒的突變特點,也可能與樣本量小、種族或未檢測 Shox外顯子 1有關,有待進一步研究。

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