虎杖配方顆粒質量標準研究

虎杖配方顆粒是蓼科植物虎杖(PolygonumcuspidatumSieb.etZucc)的干燥根及根莖制成的配方顆粒，為棕黃色至黃褐色顆粒；氣微，味微苦、澀；具有祛風利濕，散瘀定痛，止咳化痰的功效，用于關節痹痛，濕熱黃疸，經閉，癥瘕，水火燙傷，跌撲損傷，癰腫瘡毒，咳嗽痰多等癥。為有效地控制配方顆粒的質量，安徽省中藥配方顆粒工程技術研究中心按照國家食品藥品監督管理局頒發的《中藥配方顆粒管理暫行規定》通知要求，借鑒中國藥典[1]虎杖項下的鑒別和含量測定方法，參考有關文獻，采用薄層色譜法對虎杖配方顆粒進行定性鑒別，采用高效液相色譜法對虎杖配方顆粒中的大黃素與大黃素甲醚進行含量測定。結果表明，該方法簡便可行，重復性好，能有效地控制虎杖配方顆粒的質量并確保配方顆粒在不具備中藥飲片外形后臨床用藥的安全有效。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Agilent1200色譜系統(G1611A型四元泵，G1329A型自動進樣器，G1314B型VWD檢測器，Agilent化學工作站)；BT25S型電子分析天平(德國賽特利斯)；FA2104SN型電子分析天平(上海精密科學儀器有限公司)；UV-8三用紫外儀(無錫科達儀器廠)；HH型恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市金城國勝試驗儀器廠)等。

1.2 試劑

甲醇(色譜純，天津市四友精細化學品有限公司)；甲醇(分析純，鄭州派尼試劑廠)；純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)；其余試劑均為分析純。

1.3 對照品及供試品

大黃素對照品(供含量測定用，中國藥品生物制品檢定所，批號：110756-200110)；大黃素甲醚對照品(供定性鑒別用，中國藥品生物制品檢定所，批號：110758-200610)；虎杖對照藥材(由安徽中醫學院生藥教研室俞年軍教授鑒定)；虎杖配方顆粒(安徽濟人藥業有限公司、安徽中藥配方顆粒工程技術研究中心提供)。

2 方法與結果

2.1 定性鑒別

取虎杖配方顆粒粉末0.1 g，加甲醇10 ml，超聲處理15分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣加2.5 mol/L硫酸溶液5 ml，加熱水解30分鐘，自然冷卻，用三氯甲烷萃取兩次，每次5 ml，合并三氯甲烷液，蒸干，殘渣加三氯甲烷1 ml使溶解，作為供試品溶液。另取虎杖對照藥材1 g，加水60 ml，煮沸30分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇10 ml，同法制成對照藥材溶液。再取大黃素、大黃素甲醚對照品，分別加甲醇制成每1 ml各含1 mg的混合溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VIB)試驗，吸取上述四種溶液各5∶1，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(30～60℃)—甲酸乙酯—甲酸(15∶5∶1)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置日光及紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品及對照藥材色譜相應的位置上，顯相同的橙黃色斑點或熒光斑點。虎杖配方顆粒薄層色譜圖見圖1。

2.2 大黃素含量測定

2.2.1 色譜條件 Agilent HC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇—0.1%磷酸溶液(80∶20)；檢測波長：254 nm；柱溫：40℃；流速：1.0 ml/min；進樣量：10 μl；理論板數按大黃素峰計算應不低于3000。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取以五氧化二磷為干燥劑減壓干燥24小時的大黃素對照品適量，加甲醇制成每l ml中含60 g的溶液，即得。

a 可見光色譜圖

b 紫外光(365 nm)色譜圖

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品顆粒，研細，約0.1 g，精密稱定，精密加入三氯甲烷25 ml和2.5 mol/L硫酸溶液20 ml，稱定重量，置80℃水浴中加熱回流2小時，冷卻至室溫，再稱定重量，用三氯甲烷補足減失的重量，搖勻。分取三氯甲烷液，精密量取10 ml，蒸干，殘渣加甲醇使溶解，轉移至10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 測定法 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液各5 μl，注入液相色譜儀，測定，即得。結果見圖2虎杖配方顆粒液相色譜圖。

2.2.5 線性關系與范圍的考察 精密吸取對照品溶液2、4、6、8、10 μl進行色譜測定，按上述2.2.1色譜條件測定峰面積，以大黃素含量為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標繪制標準曲線，計算回歸方程為Y=14.753X+0.0108,相關系數R=1.0000，結果表明大黃素在24.0～120.0 μg/ml范圍內大黃素濃度與峰面積積分值有良好的線性關系。

a 大黃素

b 虎杖配方顆粒

2.2.6 穩定性試驗 取同一大黃素對照品溶液與供試品溶液，分別測定4次，每次間隔1小時，結果表明大黃素對照品與供試品溶液在3小時內穩定性良好，峰面積RSD值分別為0.39%和0.48%。

2.2.7 精密度試驗 取對照品溶液，連續5次重復進樣，得到峰面積積分值并計算其RSD為0.08%，結果表明儀器精密度良好。

2.2.8 重復性試驗 取同一供試品5份，按供試品制備與測定方法進行重復性試驗樣品溶液的制備并測定，得到供試品的大黃素含量為17.93 mg/g，RSD為1.90%，結果表明該方法重復性良好。

2.2.9 回收率試驗 分別稱取已知含量的樣品共5份，分別精密加入大黃素對照品溶液各0.5 ml，按供試品制備與測定方法進行回收率試驗樣品溶液的制備并測定，結果見表1。得到的大黃素回收率在97%～103%之間，平均回收率98.9%，RSD為1.91%，說明樣品制備方法和檢測方法均可行。

2.2.10 樣品含量測定 精密吸取對照品溶液、供試品溶液各10 μl，分別注入液相色譜儀，測定，外標法計算，結果見表2。

3 討論

虎杖配方顆粒為單味虎杖藥材制成的濃縮顆粒，主含蒽醌類、二苯乙烯類、黃酮類、萘醌、多糖、氨基酸及微量元素，其中游離蒽醌類主要有大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚等[1]，本實驗選用大黃素與大黃素甲醚作為其指標成分，對其用薄層色譜法進行鑒別，選用大黃素為指標成分對其進行HPLC定量研究[2]，能有效地控制虎杖配方顆粒的質量。

表2 10批樣品中大黃素含量測定結果

本試驗中薄層鑒別方法在藥典方法[2]的基礎上，加用虎杖對照藥材，因顆粒為水煎劑，故將藥材先進行水提取后同步操作進行對照，得到色譜斑點效果良好；同時在用氨蒸氣熏后斑點會變成紅色，但因其較易退去，本法并未將其列入標準中，而以直接檢視日光下的橙黃色斑點進行代替，簡化了實驗操作。

根據對虎杖原材料的測定結果和多批樣品的含量測定結果，成品含量限度為不得少于12.0 mg/袋，其中每袋裝量為1.3 g顆粒，相當于15 g虎杖飲片。

[1] 鄭虎占，董澤宏，佘靖. 中藥現代研究與應用[M]. 北京：學苑出版社，1997: 2801.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京：中國醫藥科技出版社，2005：145-146.