黃連解毒湯對(duì)幼齡自發(fā)性高血壓大鼠炎性因子、血管性假血友病因子水平的影響

原發(fā)性高血壓(essential hypertension, EH)是臨床常見的心血管疾病之一，高血壓是多種心腦血管疾病的重要病因和危險(xiǎn)因素。炎癥在高血壓病中的作用和地位已愈加受到重視。炎癥與高血壓互為因果、相互影響，是一個(gè)惡性循環(huán)的關(guān)系[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)黃連解毒湯具有良好的抗菌、消炎、提高免疫功能等作用，目前自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneity hypertension rat，SHR)為國(guó)際公認(rèn)的最接近于人類原發(fā)性高血壓的動(dòng)物模型，研究幼齡SHR可以更好的了解內(nèi)皮功能和炎性情況，因此我們本研究以幼齡SHR為研究對(duì)象，以黃連解毒湯為施加因素，觀察幼齡SHR血漿中與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的超敏C-反應(yīng)蛋白(hs-CRP)和單核細(xì)胞趨化因子-1(MCP-1)水平，內(nèi)皮功能變化，并觀察黃連解毒湯治療對(duì)幼齡SHR hs-CRP、MCP-1和vWF的水平的影響，探討黃連解毒湯對(duì)炎性因子的影響和內(nèi)皮的作用。

1 材料與方法

1.1 藥物制備

黃連解毒湯由黃連、黃芩、黃柏、梔子按3∶2∶2∶3 比例組成。其藥材均購于廣西中醫(yī)學(xué)院附屬瑞康醫(yī)院藥劑科，專人負(fù)責(zé)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，煎煮取汁，濃縮成清膏，1 g清膏相當(dāng)于1.5 g 黃連解毒湯生藥。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用雄性6周自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)16只、雄性6周正常血壓Wistar-Kyoto 大鼠(WKY)8只，體重80～130 g。SHR購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京) 2006-0009。WKY購自廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào)：SCXK(桂)2006-0003。

1.3 試劑及儀器

hs-CRP、CMP-1和vWF試劑盒，武漢中美科技有限公司生產(chǎn)；BP-6大鼠無創(chuàng)血壓測(cè)試儀，成都泰盟科技有限公司生產(chǎn)；MK3酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo生產(chǎn)；1575洗板機(jī)，美國(guó)BIO-RAD生產(chǎn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

SHR隨機(jī)分為黃連解毒湯組、模型組，每組8只。WKY大鼠為空白對(duì)照組。黃連解毒湯組：黃連解毒湯清膏蒸餾水稀釋1倍，每日上午9時(shí)按10ml/(kg·d)灌胃。模型組和對(duì)照組：每日同時(shí)按10 ml/(kg·d)蒸餾水灌胃。每日1次，連續(xù)給藥6周。

1.5 數(shù)據(jù)采集

1.5.1 血壓測(cè)量 分別于給藥前及給藥后1、2、4、6周，測(cè)量大鼠安靜清醒狀態(tài)下尾動(dòng)脈收縮壓(SBP)。每只鼠連續(xù)測(cè)量SBP 3次，間隔60 秒，取其平均值。

1.5.2 樣品采集與測(cè)定 大鼠給藥6周后，用2%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血6ml，按3000r/min離心10 分鐘，用于hs-CRP、CMP-1和vWF水平檢測(cè)。標(biāo)本均置于-20℃冰箱保存待測(cè)。測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法(ELISA)， hs-CRP產(chǎn)品編號(hào)為E0821r，CMP-1產(chǎn)品編號(hào)為E0087r， vWF產(chǎn)品編號(hào)為E0833r，操作步驟均嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理數(shù)據(jù)，兩組數(shù)據(jù)間的比較應(yīng)用t檢驗(yàn)，組內(nèi)為配對(duì)t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)幼齡SHR血壓的影響

正常情況下6周幼齡大鼠的血壓仍然處于自發(fā)性初始升高的階段。我們觀察結(jié)果如表1所示：與對(duì)照組比較，治療前模型組和黃連解毒湯組SHR與對(duì)照組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；隨著鼠齡的增長(zhǎng)模型組呈現(xiàn)血壓進(jìn)行性增高，第2周時(shí)表現(xiàn)出血壓顯著升高(P<0.05)，第6周時(shí)血壓及其顯著升高(P<0.01)；而黃連解毒湯組能降低大鼠進(jìn)行性血壓增高的趨勢(shì)，第2周血壓升高(P<0.05)，第4周時(shí)血壓恢復(fù)至對(duì)照組同等水平(P>0.05)。與同時(shí)間段模型組比，黃連解毒湯組在給藥第4周后對(duì)SHR產(chǎn)生了顯著的降壓作用(P<0.05)。與本組治療前比較，黃連解毒湯組血壓前后變化沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.2 黃連解毒湯對(duì)幼齡SHR大鼠hs-CRP、MCP-1、vWF的影響

由表2結(jié)果所示，與空白組比，模型組hs-CRP，vWF顯著升高(P<0.01)，CMP-1無顯著變化，表明SHR存在炎性反應(yīng)和內(nèi)皮功能不全。與模型組比，黃連解毒能夠顯著降低血漿hs-CRP、vWF(P<0.05)含量。

表1 實(shí)驗(yàn)前后各組大鼠血壓比較

注：與同時(shí)間段空白對(duì)照組比,aP<0.05，bP<0.01；與同時(shí)間段模型組比,cP<0.05

表2 實(shí)驗(yàn)后各組大鼠血漿hs-CRP、MCP-1、vWF的變化

注：與空白對(duì)照組比：aP<0.01；與模型對(duì)照組比：bP<0.05；取標(biāo)本時(shí)，模型組損失1只。

3 討論

自發(fā)性高血壓大鼠心血管疾病發(fā)生率高，其心血管疾病發(fā)病機(jī)制、高血壓心血管并發(fā)癥、外周血管阻力變化、對(duì)鹽的敏感性等多方面都與人類高血壓患者相似。該種大鼠出生后3～4周血壓開始升高，12～24周時(shí)達(dá)到高峰，因此出生后4～12周是血壓持續(xù)升高的重要階段。黃連解毒湯由黃連、黃芩、黃柏、梔子4味中藥按比例配伍組成，其中以黃連瀉心火、兼瀉中焦之火為君；黃芩清肺熱、瀉上焦之火為臣；黃柏瀉下焦之火，梔子通瀉三焦之火，導(dǎo)熱下行，合為佐使，共以收瀉火解毒之功，無論內(nèi)服、外服，均有良好的治療作用。黃連解毒湯及其配伍成分在心血管疾病的防治中起著越來越重要的作用，在臨床上已用于高血壓等心血管疾病的治療[2]。本研究以6周齡SHR為研究對(duì)象，目的在于考察黃連解毒湯對(duì)自發(fā)性高血壓的預(yù)防作用，從而體現(xiàn)中醫(yī)“治未病”的優(yōu)勢(shì)。

本研究表明SHR從第6 周到第12周與同齡WKY大鼠比，血壓呈進(jìn)行性增高，與模型組比較，黃連解毒湯組能抑制幼齡SHR血壓進(jìn)行性增高，表明該方能控制幼齡SHR血壓的上升，對(duì)自發(fā)性高血有一定的預(yù)防作用。

近年研究發(fā)現(xiàn)，EH的炎性反應(yīng)性主要表現(xiàn)在炎性因子對(duì)血管內(nèi)皮功能的影響。血管內(nèi)皮可分泌多種血管活性物質(zhì)如內(nèi)皮素-1(ET-1)、一氧化氮(NO)和vWF。其中vWF主要由上皮細(xì)胞合成且儲(chǔ)存于weibel-palade小體中[3]。當(dāng)血管內(nèi)皮受損時(shí)，Weibel-Palade小體發(fā)生變形性損害，vWF被釋放，血漿中vWF水平升高，因此，血漿vWF是反映血管內(nèi)皮細(xì)胞受損的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，vWF在12周齡SHR血漿中含量較空白對(duì)照組明顯增加(P<0.05)，說明在SHR在血壓達(dá)到高峰前已發(fā)生內(nèi)皮損傷，應(yīng)用黃連解毒湯之后，vWF較模型組顯著降低(P<0.05)，說明黃連解毒湯有可能能夠預(yù)防SHR內(nèi)皮受損從而降低了vWF。

內(nèi)皮受損所致的高血壓與C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein, CRP)參與的炎性反應(yīng)密切相關(guān)[4]。CRP對(duì)炎癥的反應(yīng)，實(shí)際上是炎癥反應(yīng)過程中各種細(xì)胞因子信號(hào)的一種放大。Bautista等[5]2001年首次明確血清CRP是高血壓的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。高濃度CRP可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生、遷移、動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成、發(fā)展，導(dǎo)致血管重構(gòu)、循環(huán)阻力增加。多項(xiàng)大型研究顯示超敏C反應(yīng)蛋白作為一種炎性生物標(biāo)志是心血管事件的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，同時(shí)能預(yù)測(cè)高血壓和心血管事件發(fā)生[6]。本研究中，hs-CRP在12周齡SHR中明顯高于空白對(duì)照組，有顯著的差異(P<0.05)，與其有高血壓預(yù)測(cè)作用相一致。應(yīng)用黃連解毒湯能降低hs-CRP，與模型組比較有顯著差異(P<0.05)。

MCP-1是炎癥的始動(dòng)因子及標(biāo)志[7]。在MCP-1誘導(dǎo)下，單核細(xì)胞粘附于內(nèi)皮表面，表達(dá)細(xì)胞因子參與并擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，損傷內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加使血液中的脂質(zhì)易于沉積在內(nèi)膜，此亦為As發(fā)生的早期關(guān)鍵環(huán)節(jié)。然而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，12周齡地SHR血漿中MCP-1水平有升高趨勢(shì)，但沒有統(tǒng)計(jì)意義。應(yīng)用黃連解毒湯對(duì)幼齡SHR血漿的MCP-1也無明顯影響。推測(cè)是否與治療的時(shí)間等有關(guān)，是否改變局部組織的炎性反應(yīng)亦有待研究。

總之，本研究表明SHR在血壓達(dá)到高峰前已存在內(nèi)皮功能不全，部分炎性反應(yīng)，早期應(yīng)用黃連解毒湯能預(yù)防內(nèi)皮損傷，減輕炎性反應(yīng)。通過早期抗炎和保護(hù)內(nèi)皮干預(yù)，不僅僅有利于血壓自身的好轉(zhuǎn)，更有利于控制其并發(fā)癥，本研究考察黃連解毒湯對(duì)大鼠自發(fā)性高血壓的預(yù)防作用，與中醫(yī)“治未病”相符，對(duì)有明顯高血壓家族史的人群提前預(yù)防高血壓有重要意義，這也為中醫(yī)藥抗高血壓治療策略提供了新的思路。關(guān)于黃連解毒湯具體的保護(hù)內(nèi)皮功能、抗炎作用機(jī)制尚待今后深入的研究。

[1]Vaziri ND, Rodriguez-Iturbe B. Mechanisms of disease: Oxidative stress and inflammation in the pathogenesis of hypertension[J]. Nat Clin Pract Nephro, 2006, 2(10): 582-593.

[2]李運(yùn)倫. 黃連解毒湯加減治療高血壓病30例臨床研究[J]. 國(guó)醫(yī)論壇，2000，15(2)：38-39.

[3]Lim HS, Lip GY, Blann AD, et al. Plasma von Willebrand factor and the development of themetabolic syndrome in patientswith hypertension[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2004, 89 ( 11 ): 5377-5381.

[4]李自微，趙妍，周惠華. 代謝綜合征患者血管內(nèi)皮損傷標(biāo)志物、C反應(yīng)蛋白與胰島素抵抗的關(guān)系[J]. 微循環(huán)學(xué)雜志， 2007，17(4)：47-48.

[5]Bautista LE, Lopez JP, Vera LM, et al. Is c-creative protein an independent risk factor for essential hypertension[J]. J Hypertens, 2001, 19: 857-861.

[6]Ridker PM. C-reactive protein and the prediction of cardiovas-cular events among those at intermediate risk: moving an inflammatory hypothesis toward consensus[J]. J Am Coll Cardiol, 2007, 49(21): 2129-2138.

[7]毋淑珍，趙洛沙，范萍. 氯沙坦對(duì)高血壓病患者單核細(xì)胞趨化蛋白-1的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2008，6(9)：1029-1030.