骨關節炎軟骨細胞凋亡研究進展*

三峽大學第一臨床醫學院骨科(宜昌 443002)嚴雪港 綜述 鮑同柱 審校

隨著社會人口老齡化 ,骨關節炎(Osteoarthritis,OA)發病率越來越高,已成為50歲以上男性無法參加工作的第二位原因,僅次于缺血性心臟病[1]。O A的主要病理特征為關節軟骨細胞凋亡和細胞外基質的進行性降解,以往研究大多側重于基質酶性降解和 /或合成新的基質受到抑制而導致軟骨的破壞,很少注重軟骨細胞生存或死亡在O A關節軟骨降解過程中所起的作用。近年來研究顯示,正常的軟骨細胞是維持細胞外基質穩定的必要條件,細胞凋亡是OA關節軟骨退變的關鍵因素[2]。現就軟骨細胞凋亡與O A的關系作一綜述。

1 細胞凋亡 1965年,澳大利亞科學家發現結扎鼠門靜脈后,電鏡觀察到肝實質組織中有一些散在的死亡細胞,這些細胞體積收縮、染色質凝集 ,但溶酶體并未被破壞,不同于細胞壞死。1972年,Kerr等[3]首先提出了細胞凋亡(Apoptosis)的概念,其主要特點是細胞核特征性裂解,但細胞器保持完整 ,因細胞死亡過程中無內容物的暴露,所以幾乎不導致炎癥反應。細胞凋亡是一種由基因控制的、主動地去除非需要或損傷細胞的程序性死亡過程,與生長、發育以及內環境穩定密切相關。然而,異常凋亡則是病理性和有害的 ,腫瘤、Alzheimer's病、獲得性免疫缺陷綜合征等多種疾病均與細胞的異常凋亡有關。

2 OA軟骨細胞凋亡及特點 Hashimoto[4]用流式細胞技術檢測到 OA軟骨細胞22.3%發生凋亡,而正常軟骨細胞為4.8%。 Heraud等[5]采用熒光激活細胞分類法(FACS)、原位雜交及脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL)等方法觀察人正常和 OA股骨頭關節軟骨,發現 OA患者中有 18%～ 21%軟骨細胞表現出凋亡特征,而正常關節軟骨中只有2%～5%凋亡細胞。國內學者秦泗通等[6]通過對大鼠行單側膝關節前交叉韌帶切除術(ACL T)造模后與正常組比較,凋亡指數分別為(11.31±1.34)%和(1.48±0.38)%。綜上所述,盡管軟骨細胞的凋亡比例各家報道略有差別(差異可能與檢測方法或實驗對象不同有關),但均證實了O A關節軟骨細胞的凋亡高于正常關節軟骨細胞。

與一般細胞凋亡相比,OA軟骨細胞凋亡有其獨特性:①將關節軟骨基質泡分離出來連同正常的軟骨細胞以及軟骨細胞誘生的凋亡小體進行三磷酸核苷酸磷酸脫氫酶(N TPPH)的活性檢測,發現N TPPH在軟骨細胞間隙內或軟骨基質間凋亡小體內的活性明顯升高,由于 NTPPH與鈣化沉積和骨的鈣化有關,因此凋亡小體可能有加速關節軟骨鈣化的功能[7];②由于關節軟骨中無血管分布,當軟骨細胞發生凋亡時,凋亡小體無法被巨噬細胞帶走而滯留在關節軟骨內,影響關節軟骨正常生理功能,只有當軟骨基質發生降解,凋亡小體才有可能被釋放到關節間隙中而被清除;③軟骨細胞凋亡與基質降解密切相關[8],當關節軟骨細胞過度凋亡時,由軟骨細胞合成的基質減少,破壞其生存環境,形成惡性循環。上述特點闡明了軟骨細胞凋亡在O A的發生發展中起著至關重要的作用。

3 關節軟骨細胞凋亡途徑 Hashimoto[9]研究發現,OA軟骨細胞凋亡由NO和 Fas兩種途徑介導,因NO合成的抑制劑不能抑制 Fas途徑誘導的凋亡,兩者相互獨立。

3.1 NO途徑:一氧化氮(Nitric oxide,NO)是 80年代被發現的一種具有高度反應性、細胞毒性、彌散性物質,對細菌、真菌和腫瘤細胞及正常組織均能產生殺傷作用的無機小分子,廣泛存在于生物體內。 Kaur等[10]證實NO對風濕性關節炎患者的關節損傷通過兩種途徑起作用:其一為高濃度的 NO能抑制多種與線粒體電荷傳遞系統及檸檬酸循環有關的酶;其二為NO與超氧化陰離子O2-反應生成過氧化亞硝基陰離子ONOO-,在一定條件下分解為有很強毒性的OH-和NO-自由基。OA是由一系列生物與力學因素引起的退行性疾病,其軟骨細胞能產生 IL-1、TNF-α、前列腺素和NO等大量炎性調節因子[11]。Wu等[12]和 Maneiro等[13]研究發現,無論是內源性的或外源性NO,均能通過線粒體途徑誘導軟骨細胞調亡,將人軟骨細胞通過NO外源性供體硝普鈉(SNP)或內源性供體磷酸脂多糖(LPS)和干擾素(INF)-γ、NO、活性氧(ROS)、細胞色素 C干預后,均導致 Caspases-3活性升高和DN A裂解,用NO合酶抑制劑L-單甲基精氨酸治療O A則能降低NO及其它細胞凋亡標志物的表達,有力地證明了 NO可誘導 OA軟骨細胞凋亡。

3.2 Fas途徑:Fas是位于細胞膜上Ⅰ型跨膜糖蛋白,又稱 Apo-1或 CD95,屬 TN F/NGF受體家族成員 ,是一條公認的凋亡信號傳導通路,許多細胞表達 Fas,人類 Fas基因位于第 10號染色體,FasL是Ⅱ型膜蛋白,屬腫瘤壞死因子家族成員,僅在激活的 T淋巴細胞表達,位于第 1號染色體。當 Fas與Fas-L結合后,誘導酪氨酸和蘇 /絲氨酸發生磷酸化反應,引起細胞內Ca2+濃度升高,從而活化 Caspase,引起 DN A降解,導致靶細胞凋亡[14]。正常人的軟骨幾乎看不到凋亡細胞,而在OA患者中,受損區軟骨細胞的凋亡比例明顯高于未受損區,Fas表達的結果與其相符,OA受損區的 Fas表達遠高于未受損區[15],提示Fas表達可誘導軟骨細胞凋亡。Kim等[16]發現鳥苷能增強Fas-Fasl的相互作用,從而誘導軟骨細胞凋亡,進一步佐證了 Fas途徑與軟骨細胞凋亡有關。 Hashimoto[9]等研究發現,Fas可在軟骨細胞表達,Fas-L主要由滑膜中激活的 T細胞產生,而軟骨細胞不能表達,因此 Fas途徑是與滑膜炎癥相關的細胞凋亡途徑。

4 OA關節軟骨細胞凋亡相關原癌基因的表達 軟骨細胞的存活依賴于癌基因之間的平衡,Bcl-2基因家族、P53基因、ICE基因家族、c-myc基因等均可調控軟骨細胞凋亡途徑,其中 Bcl-2基因家族和P53基因研究較為深入。

4.1 Bcl-2基因家族:Bcl-2基因是 1984年由 Tsujimto等在濾泡性淋巴瘤細胞中染色體易位 t(14:18)的斷點上發現的一種原癌基因,位于18號染色體短臂,Bax基因是Bcl-2基因家族的最主要的促凋亡基因,定位于11號染色體。該基因家族通過以下途徑來調控細胞凋亡[17]:① Bax和 Bcl-2、Bcl-X1可形成脂質雙分子層通道,Bax促進線粒體通透性轉換孔(PTP)開放,形成正反饋擴大過程,導致線粒體結構和功能的紊亂 ,線粒體外基質內流,滲透壓失衡,細胞器腫脹,線粒體的內、外膜依次裂解,釋放出Caspase,激活蛋白 ,誘導細胞凋亡,而Bcl-2、Bcl-X1抑制 PTP開放,阻止細胞凋亡;② Bcl-2直接或間接阻止細胞色素 C(CytC)從線粒體釋放,抑制細胞凋亡;③Bax同源二聚體能誘導細胞凋亡,隨著 Bcl-2蛋白表達量上升,越來越多的Bax二聚體分開,與 Bcl-2形成比 Bax-Bax更穩定的 Bax-Bcl-2異源二聚體,從而“中和”了 Bax-Bax誘導細胞凋亡的作用;④定位于內質網膜上的 Bcl-2可能通過阻斷Ca2+從內質網向胞質中的流動,使依賴 Ca2+的核酸內切酶活性降低,從而阻斷細胞凋亡;⑤Bcl-2通過抗氧化劑或抑制氧自由基的產生而發揮其抑制細胞凋亡的功能。Hashimoto[5]認為 OA患者軟骨細胞中BaxmRNA的升高是關節軟骨細胞凋亡的重要因素,而 Bcl-2mRNA表達的升高,則是機體保護軟骨細胞免遭凋亡的體現。國內學者馬春輝[18]對原發性 OA、繼發性OA和正常關節軟骨通過逆轉錄 /聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測 Bax/Bcl-2 mRNA,發現原發性 OA中 BaxmRN A和 Bcl-2mRN A均升高,而繼發性 OA中只有 Bcl-2mRN A升高,結果與Hashimoto的觀點一致。

4.2 P53基因:P53基因于 1979發現,人類 P53基因定位于17號染色體短臂(17P13.1),由11個外顯子和10個內含子組成,編碼分子量為 53-kDa的核內磷酸化蛋白,以轉錄因子的形式控制細胞增殖與 DN A修復[19]。 P53通過感知細胞 DN A損傷,靶基因編碼產物 P21可以促使細胞停留在 G1期,進行 DNA損傷修復,一旦這種修復無法完成,P53將促進一系列凋亡相關蛋白的表達 ,例如 Bax、 PUMA、Noxa、Fas、P53調控的凋亡誘導蛋白 1(P53-regulatedapoptosisinducingprotein1,P53AIP1),從而有效的誘導細胞凋亡[20]。 Okazaki等[21]檢測兔 P53mRNA水平、TUN EL檢測凋亡細胞數量,發現兔膝 OA組中明顯高于正常組,從而提示 P53在關節軟骨細胞凋亡中發揮了重要作用。有證據顯示[19],P53基因能分別誘導 Bax基因表達,抑制Bcl-2基因表達,提示 P53基因與 Bcl-2基因家族在調控細胞凋亡時具有協同作用。

5 結 語 軟骨細胞凋亡途徑受到包括 Bcl-2基因家族和 P53基因在內的許多因素調控,通過對凋亡過程中胞內信號轉導途徑與級聯反應中關鍵步驟的研究深入,利用藥物切斷其信號傳導途徑抑制軟骨細胞凋亡,已成為目前研究重點。

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