乳腺增生大鼠模型血清和乳腺VEGF、b FGF的變化△

河北醫科大學中西醫結合學院(石家莊 050091)

段彥蒼 杜惠蘭* 靳亞慈

乳腺增生病為乳腺常見病、多發病,被認為是乳腺癌癌前的一種良性病變。在病理方面除了表現在上皮細胞、間質細胞、腺泡、導管等組織的增生外,亦存在著血管的增生[1]。血管增生在乳腺腫瘤的生長、轉移過程中起到了重要作用。血管的生成與血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)和堿性成纖維細胞生成因子(Basic fibroblast growth factor,b FGF)密切相關。本研究采用肌注外源性激素刺激大鼠乳腺增生,測定其血清VEGF和b FGF及其在乳腺組織中的表達強度,以期研究V EGF和bFGF在大鼠乳腺增生中的作用。

材料和方法

1 動物模型的建立與分組 動物:75～85日齡健康清潔級雌性Wistar大鼠20只(河北醫科大學實驗動物中心提供,合格證號:602089),體重220±20g。適應性喂養 2周后,按隨機數字表法將其分為2組,每組10只:即正常對照組、模型組。正常組大鼠常規喂養,模型組參照張璐[2]等造模方法。大鼠腹腔注射苯甲酸雌二醇(天津金耀氨基酸有限公司)0.5 mg/(kg· d),連續 25d,然后注射黃體酮(天津金耀氨基酸有限公司)5 mg/(kg· d),連續 5d,建立大鼠乳腺增生的模型。

2 方 法 30d后,用游標卡尺測量第2對乳房的直徑。同時取血離心保存,用酶聯免疫法測定血清VEGF和bFGF的含量。切取第2對乳房,甲醛液固定,常規 HE染色及免疫組織化學染色(按 ABC試劑盒操作指南進行)。光鏡觀察乳腺組織形態學變化,應用日本 Nikon E800顯微鏡進行觀察,美國 IPP(Imageproplus)分析軟件對免疫組化染色切片進行圖像分析,每個切片采集5個視野,得出度量物質含量信息的灰度等級,將所得灰度值取平均數作為統計指標。平均灰度與陽性表達強弱成反比,灰度值越小,陽性染色越強,蛋白表達越多。

3 統計學分析 用 SPSS11.5統計軟件進行統計處理,數據用均數±標準差(±s)表示。對所測定結果進行正態性及方差齊性檢驗,組間比較用單因素方差分析,檢驗以P＜0.05為有統計學意義。

結 果

1 大鼠乳頭直徑的變化:正常組大鼠乳房大小正常,色淡紅,質軟,用棉簽觸壓時大鼠無明顯的痛苦感,隔毛看不見乳頭位置,將毛分開后,僅見乳頭呈小米樣,緊貼在皮膚上,蒼白、柔軟、個別稍隆起 1 mm左右。模型組大鼠乳房乳頭增大,色鮮紅,質硬,用棉簽觸壓時大鼠出現明顯的痛苦感,易激惹。乳頭豎起,較堅實,充血,增高 2～3 mm。

2 血清生殖激素變化:正常組大鼠血清為E2(15.238±8.218)pg/ml,模 型組 為E2(36.864±20.599)pg/ml,兩組相比有統計學差異(P＜0.01);正常組大鼠血清 P(57.047±17.014)ng/ml,模型組大鼠血清 P(31.571±5.821)ng/ml,兩組相比有統計學差異(P＜0.01);正常組大鼠血清 PRL(7.947±1.459)ng/ml;模型組大鼠血清 PRL(9.912±4.206)ng/ml,兩組相比有統計學差異(P＜0.05)。

3 血清 VEGF、bFGF含量:正常組血清 VEGF為(16.414±3.798)pg/ml,模型組為(21.357±4.816)pg/ml;正常組血清 b FGF為(244.370±57.431)pg/ml,模型組為(507.900±79.051)pg/ml。與正常組相比,模型組大鼠血清中 VEGF和bFGF含量均明顯升高(P＜0.01)。

4 乳腺組織 V EGF、b FGF的表達:乳腺 VEGF、b FGF的陽性表達定位于細胞漿內,為棕黃色染色。正常組乳腺組織 VEGF表達平均灰度為84.76±8.30,模型組為62.89±8.05;正常組乳腺組織 bFGF表達平均灰度為102.00±4.90,模型組為77.61±5.08。與正常組相比,模型組大鼠乳腺組織中 VEGF、bFGF的表達增強(P＜0.01)。

討 論

研究表明乳腺癌患者VEGF蛋白在乳腺的表達和MVD數值呈正相關[3]。乳腺癌中彩色血流分級隨著VEGF表達水平的增強而明顯增高[4]。V EGF是目前已知的促使血管內皮細胞通透性增加的作用最強的誘發因子[5]。VEGF又稱為血管滲透因子,是一種內皮細胞特異性有絲分裂原,具有核心作用,還能誘導內皮細胞增殖、遷移,具有特異性促進內皮細胞分裂增殖并增加血管通透性的活性促進血漿蛋白外漏,基底膜降解,最終導致新的基質及新生血管形成。因此在乳腺癌的發生、發展、浸潤和轉移中發揮重要作用[6,7]。

在血管形成的調控中,b FGF起著關鍵作用。bFGF能促進表皮、內皮細胞再生,促進血管內皮細胞分裂,誘導其從基膜中分離出來,以刺激內皮細胞向腫瘤組織趨化運動,并形成管狀結構,還可提高組織中血纖維蛋白溶解酶原激活因子類(PAs),誘導內皮細胞產生其他蛋白酶,是血管形成較為直接的誘導物[8]。

經典理論認為乳腺增生病的發生與內分泌紊亂,卵巢功能失調有關。體內長時間的孕激素(P)不足與雌二醇(E2)絕對或相對增多,是乳腺組織發生增生的主要原因。依據該理論,近幾年,研究學者常采用肌注外源性激素的方法或摘除實驗動物雙側卵巢的方法來復制動物乳腺增生的模型,我們認為通過手術摘除動物的卵巢本身會對實驗動物造成機體的損害,可能影響實驗的準確性,所以本實驗采用保守的肌注外源性激素的方法來復制大鼠乳腺增生的模型。造模后,與正常組相比,模型組大鼠的乳頭豎起,較堅實,充血,增高 2～3mm,模型大鼠VEGF和bFGF在乳腺組織的表達均較正常組明顯升高,提示模型組大鼠體內存在的某些血管因子被激活后,直接或間接促進了局部乳腺組織血管的增生而造成乳腺增生。有學者證實乳腺癌患者血清VEGF表達明顯高于健康志愿者,并與與乳腺癌的進展、惡性程度、腋窩淋巴結轉移相關,認為可作為判斷乳腺癌惡性程度和淋巴結轉移的一個生物學指標[9],在本實驗中模型大鼠血清VEGF和b FGF水平均較正常組明顯升高,提示血管生成因子表達的強弱可能與乳腺腫瘤的發展密切相關。

[1] 劉勝春,吳凱南,歷江元.血管生成在乳腺非典型增生病變過程中的作用.中國腫瘤臨床,1998,23(6):421.

[2] 張 璐,喬國芬,楊寶峰.中藥乳腺丸對乳腺增生的影響.中國中西醫結合外科雜志,2003,9(1):39-41.

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[8] 易文君,唐中華,楊竹林,等.青年和絕經女性乳腺癌V EGF、b FGF及其受體表達的差異.中華腫瘤雜志,2003,25(2):141-145.

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