細胞生長因子誘導骨髓基質干細胞成骨的研究進展

劉道華綜述,夏德林審校

(瀘州醫學院附屬口腔醫院口腔頜面外科,四川瀘州646000)

骨髓基質干細胞(bone mesenchymal stem cells,BMSC)被認為是骨組織工程中最有應用前景的理想種子細胞[1]。由于BMSCs具有分化多方向性的特點,而骨組織工程學要求其向單一方向分化,所以,BMSCs的定向誘導具有重要作用。就其成骨方向來說,常用的具有誘導作用生長因子有骨形態發生蛋白(BMP)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、轉化生長因子-β(TGF-β)、胰島素樣生長因子(IGF)、血管內皮生長因子(VEGF)等。它們不僅可單獨作用,相互之間也存在著密切的關系,可復合使用。本文就細胞生長因子對BMSCs分化及增殖的誘導作用作一綜述。

1 骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)

骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)是一組疏水性的酸性糖蛋白,屬于轉換生長因子超家族。BM P是一組具有很強骨誘導活性的生長因子,可能是誘導骨髓基質干細胞向成骨細胞系轉化的基本信號因子,其中研究最多也是成骨活性最強的是BMP-2和BMP-7。BMP-2可明顯加速BMSCs向成骨細胞轉化,可促進成骨細胞前體細胞向成骨細胞轉化。研究表明,BM P首先與細胞膜上的絲氨酸/蘇氨酸激酶受體相結合,形成Ⅰ、Ⅱ型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體的二聚體,然后將信息轉導入細胞內,經第 2信使M AD(matheragainst dpp)的磷酸化,將信息導入細胞核內,從而激活或調整DNA的結合活性,使BMP活性相關的基因表達,產生相應的生物效應。

對BM P的骨誘導活性人們看法比較一致,其在體內通過募集間充質細胞,并誘導其向成骨細胞或成軟骨細胞方向分化,同時協同其他調節因子共同參與誘導骨形成;在體外不僅能夠調節成骨細胞的轉化,對骨祖細胞以及間充質細胞均具有強烈的骨誘導活性,而且可能使誘導性骨細胞向確定性骨細胞轉化。但其對細胞增殖的影響目前尚有爭論。Akino等[2]用BMP-2及bFGF誘導人BMSC發現用BMP-2誘導的無血清培養的BMSC在2d時細胞數目顯著增多并達到平臺期,且BMP-2和bFGF有明顯的協同作用二者合用可使平臺期后延。用熒光激活分選術進一步表明BMP-2使細胞周期前移G2/M期細胞比例增多。研究證實,重組人BM P-2(rhBMP-2)能夠提高人BM SC及肋骨來源的成骨細胞內堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素、Ⅰ型膠原 mRNA的表達。Boden[3]以 LMP-1(潛在性膜蛋白-1)cDNA轉染骨髓細胞,在脊柱融合模型中局部植入可誘導實驗組100%脊柱融合,而對照組未見成骨。有研究表明用地塞米松處理成纖維樣的骨髓基質細胞向成骨細胞分化時表達BMP-2,而ascorbic acid作用于骨髓基質細胞時,發現它可通過誘導Ⅰ型膠原形成,繼而激活包括BMPs的信號通路,促進骨基質細胞系ST2細胞的成骨性分化。用simvastatin作用于骨髓基質細胞可以增加osteocalcin mRNA的表達與堿性磷酸酶的活性,誘導 BMP-2的表達,促進成骨[4-5]。有學者運用分子生物學技術,將骨形態發生蛋白2基因轉入細胞內,在表達載體的作用下,產生具有生物學活性的骨形態發生蛋白2二聚體,并分泌到細胞外,誘導骨髓基質干細胞向軟骨細胞和成骨細胞方向分化,促進骨組織生成[6-9]。

2 成纖維細胞生成因子(fibroblast growth factor,FGF)

根據等電點的不同,將其分為酸性和堿性兩種,廣泛存在于腦、垂體、肝、腎、骨、軟骨等多種組織細胞中,是一種廣譜的有絲分裂源,對來源于中胚層和神經外胚層的細胞具有明顯的促增殖作用,不僅能夠促進軟骨及骨組織的形成,并且是一種強烈的毛細血管形成刺激劑[10],也是形態發生和分化的誘導因子,在正常生理和病理過程中參與生長發育和組織損傷修復過程。bFGF能夠促進BMSCs體外培養成纖維細胞集落的形成,促進細胞的增殖,但對BMSCs的轉化作用仍存在不同的研究結果。有研究證實在地塞米松存在的培養環境中,bFGF作用6d時可顯著增加細胞增殖,同時骨鈣蛋白表達、骨礦化結節形成。BMP-2的促轉化作用不如bFGF明顯,兩者聯合應用時促BM SCs轉化作用強于單一因子。在眾多生長因子中bFGF對BMSCs具有最強的促分裂作用,同時經bFGF作用的細胞植入體內表現出較強的成骨能力。

成纖維細胞生長因子18是新近克隆的成纖維細胞生長因子家族成員之一,已被證實是一種發育組織重要的分泌性信號分子,在骨骼和軟骨的發育中發揮著重要的作用[11]。有文獻報道骨髓基質干細胞表面表達有 FGF的受 體,對FGF有良好的反應,體外實驗也發現,其對骨髓基質干細胞增殖和分化為成骨細胞的作用遠強于BMP-2。有實驗觀察到FGF-2在體外可以促進骨髓基質細胞向成骨細胞分化增殖,FGF-2處理骨髓基質細胞后可顯著增加它們的增殖潛能以及子代細胞的數量與克隆的大小,提高非造血前體細胞與骨髓成纖維細胞表面分化抗原與堿性磷酸酶的表達,在加入地塞米松后可促進其進一步的成熟。

3 轉化生長因子-β(transforming growth factor β,TGF-β)

TGF-β是一族具有多種功能的蛋白多肽,相對分子質量100～250kd,廣泛存在于人體組織中的生長因子,以骨和血小板中含量最高,參與人體許多組織的炎癥和修復反應,是較強的促成骨分化的因子。

體外實驗表明,TGF-β可促進骨膜間充質細胞的增殖和分化,促進成骨和成軟骨細胞的增殖,刺激Ⅱ型膠原、骨粘連蛋白和骨橋蛋白的合成。研究發現TGF能夠抑制BMSCs的增殖,但能提高其成骨細胞ALP的表達,并能減少和延遲BMSCs向脂肪細胞的轉化。基因重組人轉化生長因子β可以誘導BMSCs向成骨細胞分化和成熟。有研究表明 TGF-β1和BMP在對基質干細胞向骨細胞方向分化的作用是不同的,TGF-β1在基質干細胞向成骨細胞分化的早期階段起關鍵作用,而BM P則促進成骨前體細胞的存活和成熟。TGF-β對BMSC的作用與細胞分化程度有關,早期促進增殖晚期促進分化。TGF-β對多種細胞具有促分化效應,是較強的促成骨分化的因子。有研究發現TGF-β能夠抑制BMSC增殖,但能提高其ALP的表達,并能減少和延遲BMSC向脂肪細胞轉化,從而提高BMSC的成骨效應。

4 血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)

VEGF是一種糖蛋白,其相對分子質量為 34～45kd,由兩個相對分子質量各為17～22kd的不同亞單位組成的二聚體。人類VEGF基因位于染色體 6P12,全長 14kb,由 8個外顯子和7個內含子組成。由于VEGF mRNA有不同的剪接方式,所產生的VEGF蛋白主要有5種亞型,近年來研究表明,血管內皮生長因子對中胚層細胞分化有作用,可以使骨髓基質干細胞向成骨分化。有研究發現,外源性VEGF能使體外培養的成骨細胞ALP活性及cAM P濃度提高4倍。VEGF誘導成骨細胞遷移,增加ALP活性,同時成骨細胞自身合成VEGF。PGE1,PGE2,1、25(OH)維生素D3及IGF2Ⅰ能增加成骨細胞VEGF mRNA的表達。

通過對外源性血管內皮細胞生長因子修復鼠下頜骨缺損進行組織學觀察,發現血管內皮細胞生長因子組標本內血管形成明顯增加,骨組織的再生也增加,證實了局部應用血管內皮細胞生長因子能促進骨組織再生[12]。近年來有研究證實血管內皮細胞生長因子在血管再生中起著重要作用。它通過促進血管內皮細胞的有絲分裂、血管通透性的增加及增進單核細胞的趨化性等促進血管的再生。血管內皮細胞生長因子不僅能促進血管的再生,而且能調節成骨細胞的成骨活性,使其能更好地分泌細胞外基質,從而促進成骨。

5 胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor,IGF-1)

IGF-1是由70個氨基酸組成的單鏈多肽,相對分子質量7.7kd,由3個二硫鍵交叉連接,被認為是軟骨細胞合成代謝的主要促生長因子。IGF-1通過與IGFBPs(IGF-binding protein)相互作用來調節其生物學功能。IGF-1可刺激單層培養中人軟骨細胞的增殖,且與其劑量呈正相關。Kellner等[13]在實驗中發現IGF-1在體外軟骨組織工程中具有顯著的正面效應。而胰島素也被證明能夠與IGF-1的受體相結合,并產生相同的效應。他們在試驗中將牛關節軟骨細胞在多聚葡酸(PGA)支架上培養7周。結果顯示體外胰島(0.05～50mg/mL)能夠促進組織工程軟骨的生長速度及多聚葡酸的聚集,并能優化軟骨形態,其中以2.5mg/mL的濃度時效應最為明顯。IGF-1與透明質酸聯合應用時具有顯著的促進組織工程軟骨細胞生長的作用[14]。IGF-1與bFGF或 TGF-β2的混合物也可明顯促進組織工程軟骨的發生以及Ⅱ型膠原的生長[15]。

6 基因修飾(gene-modified)

許多生長因子如 BM P-2、BMP-7、TGF-β、bFGF等不僅可通過人工基因重組產生,而且能以病毒或非病毒載體通過體外轉移的方法導入BMSC內并有效表達,用來修復骨缺損取得了良好的效果。有學者利用腺病毒通過體外轉移的方法將BMP-2基因導入骨髓基質細胞,然后將該骨髓細胞與脫礦骨基質復合后修復小鼠股骨缺損,術后2個月,24處骨缺損中有22處骨性愈合[16]。有學者比較了腺病毒、逆轉錄病毒、脂質體載體對轉hBMP-2基因小鼠MSC修復顱骨缺損的效果差異,發現腺病毒組成骨效果最顯著,脂質體組最少。研究表明將TGF-β1基因的復制缺陷型病毒轉入成骨細胞中,轉染后成骨細胞中TGF-β1mRNA的表達仍保持在明顯的上調狀態,細胞分泌合成的TGF-β1較對照組高 46倍,細胞Ⅰ型膠原含量提高了5倍,將轉染了 TGF-β1的成骨細胞植入體內可明顯增加新生骨組織的數量?；蛐揎椄杉毎?可實現BMSC在體外長期擴增并維持某些干細胞的多向分化潛能特性,文獻證實利用端粒酶逆轉錄酶(telomerase reverse transcrip tase,TERT)基因修飾的MSC體外連續傳代培養3年后,仍保持良好的自我更新和多向分化潛能[17]。利用TERT基因修飾的MSCs建立種子細胞庫有可能解決目前骨組織工程臨床應用中種子細胞來源的難題,但其所致永生化細胞是否有致瘤性尚需進一步研究。實驗采用局部基因治療的方式,將攜帶有骨形態發生蛋白2真核表達載體導入機體特定部位的細胞內,通過實驗證實其具有誘導異位成骨作用,并能有效促進兔橈骨缺損的修復[18]。

細胞生長因子通過調節BMSC增殖、分化過程并改變細胞產物的合成而作用于成骨過程,隨著基因技術的發展,對基因載體的研究日益受到研究者的重視。目前報道應用的基因載體有真核表達載體cDNA載體、腺病毒、腺相關病毒、逆轉錄病毒、猴空泡病毒(SV40)等。將編碼特定生長因子的基因導入BM SC,使目的基因在細胞內表達并合成具有骨誘導作用的生長因子,從而克服了外源性生長因子在體內半衰期短、需反復給藥、大劑量給藥有不良反應等缺點,是骨組織工程的又一重要研究方向。

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