不同細胞因子在體外誘導耐受性樹突狀細胞的作用*

鐘志宏,鄢 俊,張品俊綜述,陳國安審校

(1.贛南醫學院教務處,江西贛州341000:2.贛南醫學院第一附屬醫院,江西贛州341000;3.南昌大學第一附屬醫院,南昌330006)

樹突狀細胞(dendritic cell,DC)是體內功能最強的專業性抗原呈遞細胞,近年來,DC在免疫應答中的雙向調節作用引起了移植學者的廣泛關注,其中耐受性樹突狀細胞(tolerogenic dendritic cells,tDCs)能夠誘導特異性T細胞免疫耐受。由于DC主要分布在肝、心、腎等非淋巴器官,數量極為有限,幾乎不可能從新鮮組織大量分離獲取,對其研究多依賴體外應用細胞因子誘導擴增。目前發現,骨髓細胞或外周血單核細胞在某些細胞因子調節下可在體外定向誘導生成tDCs,如粒/巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)、血管活性腸肽、地塞米松、脂多糖。此外,白細胞介素 10(IL-10)、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)和阿司匹林(Aspirin)也有助于 tDCs生成。本文就不同細胞因子在體外誘導tDCs的作用進行綜述。

1 GM-CSF的作用

GM-CSF屬于造血生長因子,對體內肝星狀細胞(HSC)分化為DC具有促進作用,同時GM-CSF還能促進體內DC的成熟與活化。GM-CSF是體外擴增tDCs的最重要的細胞因子,常被單獨或與其他細胞因子聯合使用培養tDCs。有研究結果表明,常規劑量GM-CSF下培養出的DC為成熟DC和未成熟DC(immature dendritic cells,iDC)的混合體,而在極低劑量GM-CSF下可培養出較單純的iDC。低GM-CSF的環境僅適于某種DC亞型的分裂增殖,這種DC亞型高水平分泌IL-10,抑制了自身的分化成熟。與成熟DC相比,iDC最顯著的表型特征是不表達或低表達協同刺激分子,這也被認為是其誘導免疫耐受的主要分子基礎。有實驗顯示:用小鼠的骨髓細胞作DC前體細胞,適合于培養iDC,而利用細胞因子體外誘導iDCs是培養tDCs的基本方法,其中,低劑量GM-CSF被認為是誘導tDCs最重要的細胞因子。

2 血管活性腸肽的作用

血管活性腸肽是由28個氨基酸組成的直鏈肽,相對分子質量3 323,屬胰高血糖素-胰泌素家族,其結構與垂體腺苷酸環化酶活性肽(PACAP)很相似,藥理學效應也相似。越來越多的證據表明,血管活性腸肽能下調DCs共刺激分子和加強DCs對T細胞誘導向Th2型偏倚作用,提示血管活性腸肽具有誘導tDCs生成作用[1-2],實驗也證明了血管活性腸肽誘導生成的tDCs刺激 T細胞反應能力很弱[3]。Chorny等[4]用經血管活性腸肽誘導的DC(DCVIP)與同種異體反應性CD4+T細胞共培養,結果顯示對T細胞的刺激能力非常弱。此外,經DCVIP與CD4+T細胞共同混合培養的CD4+T細胞,再次與同種異體成熟DC共培養也不能擴增[1],提示DCVIP誘導了失能T細胞,或Treg細胞[5]。實驗也證明DCVIP誘導生成的T reg細胞具有分泌IL-10、TGF-β的能力,并能抑制同基因型的效應T細胞擴增。表明血管活性腸肽能誘導tDCs,進一步誘導T reg細胞產生[6],從而發揮誘導抗原特異性免疫耐受作用。

3 地塞米松的作用

地塞米松相對分子質量為392.47,是一種人工合成的腎上腺皮質激素,是免疫抑制劑,目前研究認為,地塞米松可影響DC的分化和發育,在器官移植后更好地誘導移植免疫耐受。地塞米松處理過的DC,其協同刺激分子CD86的表達水平降低[7],具有抵抗脂多糖刺激DC成熟的能力(可能意味著 Toll樣受體4的表達較低),且其刺激同種異基因T細胞的增殖能力很弱,說明地塞米松可使DC處于穩定不成熟狀態,還可使DC協同刺激分子的表達水平降低而成為“耐受原DC”,從而誘導免疫耐受。有實驗聯合應用血管活性腸肽和地塞米松誘導tDCs效果最佳,推測血管活性腸肽、地塞米松在誘導tDCs方面可能存在協同作用,使DCs共刺激分子表達下調,有利于骨髓單個核細胞定向分化為tDCs。

4 脂多糖的作用

目前大多數學者認為,iDC誘導免疫耐受,成熟DC誘導免疫應答反應[8]。然而iDC具有不穩定性,在各種細菌、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素γ(INF-γ)等因子的作用下均可迅速發育成熟。脂多糖(LPS)是含糖和脂質的化合物,在組成上糖的分量多于脂,故名。有實驗采用血管活性腸肽、地塞米松與GM-CSF等細胞因子誘導小鼠骨髓單個核細胞生成tDCs,在進一步加入LPS誘導成熟后仍保持免疫耐受特性[9],低表達共刺激分子(CD40,CD80和CD86),低分泌IL-12而高分泌IL-10[10],刺激T細胞向 Treg細胞分化增殖[11]。推測iDC可能存在不同亞型的DC,tDCs和免疫性DC,其分別調節機體免疫平衡。有實驗認為小鼠骨髓細胞經低劑量GM-CSF體外誘導可分化為iDC,經LPS刺激后,DC表達CD40呈現部分激活狀態,IL-10明顯升高,使IL-10/IL-12上升,一方面抑制了DC分化成熟,另一方面這種自分泌Th2細胞因子充當抗原提呈第3信號,更有利于T淋巴細胞失能和誘導耐受型T輔助細胞,擁有更強的致耐受性。

5 IL--10的作用

IL-10是一種多效性細胞因子,可作用于不同免疫細胞,作用復雜兼有免疫刺激和免疫抑制效應。IL-10可調節髓系細胞的細胞因子、可溶性介質的分泌和細胞表面分子的表達,影響其參與免疫、炎癥反應的能力[12]。IL-10系抑制單核細胞分化為DCs的主要因子,能強烈阻斷多種因子刺激DC成熟,如IL-10可抑制人血中單核細胞在含GM-CSF和IL-4培養條件下產生iDC,亦抑制內毒素、CD40L或TNF-α對iDC的活化成熟作用。在缺乏GM-CSF和IL-4時,IL-10誘導單核細胞分化成巨噬細胞樣細胞。對新鮮分離或培養的漿細胞系DC,IL-10可誘導其凋亡。IL-10對小鼠骨髓來源的髓系DC的作用與人有所不同,一方面抑制其成熟使MHC分子表達低下,另一方面則上調共刺激分子CD40、CD80、CD86的表達,說明小鼠在IL-10存在下誘導產生了不完全成熟的髓系DC,后者缺乏活化T細胞的能力。DC在發揮免疫作用時會分泌IL-12,IL-10可抑制各型DC產生IL-12和表達共刺激分子,因此削弱了DCs刺激Th1細胞反應的能力。有資料證實,IL-10可明顯阻止吞噬細胞(如DC)中IL-12p40的基因轉錄過程,因而下調DC中IL-12的表達,減少IL-12的分泌,進而減弱DC的抗原呈遞功能[13]。這或許從分子水平解釋了IL-10對DC的抑制作用。IL-10處理過的DCs不僅能削弱T細胞反應的能力,而且可介導抗原特異耐受狀態。同時,IL-10還能夠抑制過敏反應和自身免疫反應,誘導腫瘤逃避免疫監視。

IL-10是體內抑制性細胞因子,可下調DCs表面M HC-Ⅱ類分子、共刺激分子、黏附分子及成熟DCs特異性標志CD83的表達。IL-10能誘導Th0向Th2反應偏倚,并抑制IL-12合成。IL-10還可促進單核細胞來源的DC誘導抗原特異性CD4+和CD8+T細胞免疫無能,表現為T細胞增殖減弱,IL-2、IFN-γ分泌降低。此類DC主要對抗成熟信號,可抑制T細胞免疫應答,誘導T細胞耐受或產生 Treg細胞[14]。

6 TGF-β的作用

TGF-β是屬于一組新近發現的調節細胞生長和分化的TGF-β超家族。近年積累的大量實驗證據表明,機體可能更主要地通過CD4+、CD25+調節性 T細胞以“主動”的方式維持自身免疫耐受。CD4+、CD25+T細胞是機體中主要的調節性T細胞,在體內發揮免疫調節功能。CD4+、CD25+T細胞能分泌TGF-β和IL-10[15],這兩種細胞因子都能抑制DCs的成熟,因而它能誘導tDCs的產生。有研究用骨髓來源DC與CD4+、CD25+T細胞共培養,發現DCs能刺激 CD4+、CD25+T細胞活化增殖,這種刺激作用需通過細胞間的相互接觸來實現,增殖后的CD4+、CD25+T細胞仍保持原有的抑制作用,這為DCs調節自身免疫和其它免疫反應提供了一種新的作用機制。有研究發現,TGF-β誘導后DC表面抗原CD40,CD80,CD86及MHC-Ⅱ類分子的表達都有明顯下降[16],并明顯抑制了混合淋巴細胞反應(MLR)中同種異體T細胞增殖,說明TGF-β能夠通過下調DC表面協同刺激分子的表達,降低DC成熟狀態,抑制T細胞活化、增殖,進一步抑制DC誘導免疫反應的能力。另有學者研究認為TGF-β可促使DC維持在不成熟狀態,這種iDC可以誘導T淋巴細胞的低應答,在誘導移植免疫耐受中發揮著重要作用。

此外,TGF-β在傷口愈合和組織修復中具有重要作用。TGF-β需經蛋白水解或傷口中的酸性環境激活。在受傷和炎癥發生后,滲出的細胞成為TGF-β的主要來源。產生和釋放的TGF-β刺激成纖維細胞合成膠原和其他細胞外基質并抑制膠原蛋白的降解,趨化成纖維細胞和巨噬細胞。這些作用與組織的修復相關,在某些條件下可以恢復組織的正常結構,并可能導致組織纖維化。

7 阿司匹林的作用

目前認為tDCs誘導免疫耐受的機制主要為低水平表達MHC-Ⅱ類分子,不表達或低水平表達共刺激分子(CD80、CD86)和CD40。由于在T細胞激活過程中缺少了免疫應答所必需的第二信號,T細胞不能被活化增殖,體外刺激T淋巴細胞增殖的能力較弱。相反tDCs可誘導抗原特異性T細胞無能或凋亡,從而誘導抗原特異性耐受。而常規DCs在LPS的刺激下發育成熟,能為T細胞活化提供所必需的表面分子,因此刺激T細胞增殖的能力較強。阿司匹林是乙酰水楊酸類藥,廣泛用于解熱鎮痛、消炎、抗風濕、抗血小板聚集等處,是臨床上最常用的藥物之一。有研究發現阿司匹林-處理的DCs低水平的表達CD40、CD80、CD83和 CD86,對免疫刺激呈耐受性[17]。有研究觀察到阿司匹林不影響骨髓單個核細胞向DC分化,對DC活力亦無顯著影響;但可明顯抑制DC表面的CD86、CD80共刺激分子表達,從而誘導T淋巴細胞無能,且其促進T淋巴細胞增殖能力明顯減弱,說明阿司匹林有免疫抑制功能。

DC的發育、成熟和生物學功能表達的過程有其時序性,存在正反饋和負反饋,有DC自身的反饋,也有其他細胞的影響,如T細胞、NK細胞,甚至上皮細胞。體內和體外實驗都證明,DCs通過與NK細胞接觸而形成免疫突觸,借助分泌的細胞因子,促進了NK細胞的活化增殖并增強其細胞毒性,提高了NK細胞清除病原微生物的能力。激活的NK細胞也能夠誘導DCs的成熟并選擇性殺傷iDCs。NK細胞分泌的IFN-γ又可有效地啟動和調節Th1應答和特異性T淋巴細胞(CTL)反應。因此,NK細胞和DCs相互作用是一個正反饋過程。更令人興奮的是,有研究發現tDCs能刺激初始T細胞轉化成調節性T細胞,反過來,CD4+、CD25+T細胞也能促進 DC前體細胞分化為具有耐受性的DCs。這樣 tDCs與Treg細胞[18]之間形成了一個抑制性的反饋,在誘導和維持免疫耐受中起重要作用。這說明DCs與CD4+、CD25+T細胞在誘導免疫耐受中是相互促進,相輔相成的。

目前已發現多種細胞因子參與tDCs的體外誘導增殖過程,但目前對tDCs的研究多局限于體外實驗,在復雜的體內環境中,其分化途徑和影響功能的因素都不十分肯定,很可能是多種因素綜合作用的結果,而且存在復雜的調控機制。例如:體內單核細胞、肥大細胞、T調節細胞和腫瘤細胞等多種細胞均分泌IL-10。在IL-10的刺激下,DC誘導Th細胞向Th2細胞分化,后者再分泌 IL-10,作用于 DC,形成正反饋效應,進而抑制免疫反應;體內單核細胞、B淋巴細胞及其他輔助細胞可產生IL-12,它可增加許多效應細胞包括T淋巴細胞、自然殺傷細胞和巨噬細胞的溶細胞作用,誘導細胞因子如IFN-γ的產生,刺激Th1細胞的形成。因此,tDCs體內誘導免疫耐受的影響因素還有待進一步研究,為tDCs在預防移植免疫排斥反應和治療某些自身免疫性疾病的臨床應用提供實驗依據[19]。

[1]Weng Y,Sun J,Wu Q,et al.Regulatory effects of vasoactive intestinal peptide on the migration of mature dendritic cells[J].J Neuroimmunol,2007,182(1-2):48.

[2]Gonzalez-Rey E,Delgado M.Role of vasoactive intestinal peptide in inflammation and autoimmunity[J].Curr Opin Investig Drugs,2005,6(11):1116.

[3]Delgado M,Chorny A,Ganea D,et al.Vasoactive intesti-nal polypeptide induces regulatory dendritic cells that prevent acute graft versus host disease and leukemia relapse after bone marrow transplantation[J].Ann N Y Acad Sci,2006,1070:226.

[4]Chorny A,Gonzalez-Rey E,Delgado M.Regulation of dendritic cell differentiation by vasoactive intestinal peptide:therapeutic applications on autoimmunity and transplantation[J].Ann N Y Acad Sci,2006,1088:187.

[5]Gonzalez-Rey E,Chorny A,Fernandez-Martin A,et al.Vasoactive intestinal peptide generates human tolerogenic dendritic cells that induce CD4 and CD8 regulatory T cells[J].Blood,2006,107(9):3632.

[6]Delgado M,Gonzalez-Rey E,Ganea D.Vasoactive intestinal peptide:the dendritic cell--＞regulatory T cell axis[J].Ann N Y Acad Sci,2006,1070:233.

[7]邱勇,李冬妹,何秀娟,等.雷帕霉素和地塞米松對小鼠樹突狀細胞分化成熟的調控[J].細胞與分子免疫學雜志,2006,22(5):582.

[8]Griffiths KL,O′Neill HC.Dendritic cells as immune regulators:the mouse model[J].J Cell M ol Med,2008,12(5B):1909.

[9]Salazar L,Aravena O,Contreras-Levicoy J,et al.Shortterm lipopolysaccharide stimulation induces differentiation of murine bone marrow-derived dendritic cells into a tolerogenic phenotype[J].Eur Cytokine Netw,2007,18(2):78.

[10]Anderson AE,Swan DJ,Sayers BL,et al.LPS activation is required for migratory activity and antigen presentation by tolerogenic dendritic cells[J].J Leukoc Biol,2009,85(2):243.

[11]Fu CL,Chuang YH,Huang HY,et al.Induction of IL-10 producing CD4+T cells with regulatory activities by stimulation with IL-10 gene-modified bone marrow derived dendritic cells[J].Clin Exp Immunol,2008,153(2):258.

[12]Kavousanaki M,Makrigiannakis A,Boumpas D,et al.Novel role of plasmacytoid dendritic cells in humans:Induction of interleukin-10-producing treg cells by plasmacytoid dendritic cells in patients with rheumatoid arthritis responding to therapy[J].Arthritis Rheum,2009,62(1):53.

[13]Vernal R,León R,Silva A,et al.Differential cytokine expression by human dendritic cells in response to different Porphyromonas gingivalis capsular serotypes[J].J Clin Periodontol,2009,36(10):823.

[14]Henry E,Desmet CJ,Garzé V,et al.Dendritic cells genetically engineered to express IL-10 induce long-lasting antigen-specific tolerance in experimental asthma[J].J Immunol,2008,181(10):7230.

[15]Maynard CL,Hatton RD,Helms WS,et al.Contrasting roles for all-trans retinoic acid in TGF-beta-mediated induction of Foxp3 and Il10 genes in developing regulatory T cells[J].J Exp Med,2009,206(2):343.

[16]Lee TH,Cho HK,Cho YH,et al.Development of an effective method for dendritic cell immunotherapy of mouse melanoma[J].Scand J Immunol,2009,70(2):85.

[17]Buckland M,Lombardi G.Aspirin and the induction of tolerance by dendritic cells[J].Handb Exp Pharmacol,2009,188:197.

[18]Thomson AW,Turnquist HR,Zahorchak AF,et al.Tolerogenic dendritic cell-regulatory T-cell interaction and the promotion of transplant tolerance[J].Transplantation,2009,87(9 Suppl):S86.

[19]Fujii S,Takayama T,Asakura M,et al.Dendritic cellbased cancer immunotherapies[J].Arch Immunol Ther Exp(Warsz),2009,57(3):189.