茶樹腋芽初代培養過程中外植體褐化的控制措施研究

雷攀登，孫俊，張正竹?

（1.安徽農業大學茶及藥用植物安全生產重點開放實驗室，合肥 230036；2. 安徽農業大學園藝學院，合肥 230036）

茶樹腋芽初代培養過程中外植體褐化的控制措施研究

雷攀登1，孫俊2，張正竹1?

（1.安徽農業大學茶及藥用植物安全生產重點開放實驗室，合肥 230036；2. 安徽農業大學園藝學院，合肥 230036）

有效控制外植體褐變是茶樹組織培養的關鍵技術。本文研究了外植體取材季節、切取方法、培養溫度和不同抗氧化劑對外植體褐變率的影響。結果表明：春季材料的外植體污染率、褐變率比秋季的低，腋芽萌發率比秋季的高；外植體留部分葉柄、接種前用2.0 g?L-1PVP溶液浸泡30 min、接種后在8℃避光培養16h可以有效降低外植體褐化率。春季材料、合適的外植體類型、培養溫度及抗氧化劑的良好組合，有助于提高茶樹腋芽初代培養的成功率。

茶樹；腋芽；組織培養；褐化

褐化現象在植物組織培養中普遍存在，外植體褐化是植物組織培養的一大難題。在木本植物組織培養過程中，外植體褐化現象普遍發生。褐化的主要原因是外植體組織被切割后，多酚類化合物從切口處向外分泌，多酚氧化酶被激活，多酚類物質被氧化形成褐色有毒的醌類物質，損傷切面迅速變成棕褐色或暗褐色，褐色物逐漸向培養基中擴散，抑制其它酶的活性，毒害整個外植體組織，外植體隨之進一步變褐而最終死亡[1,2]。外植體的基因型、外植體年齡、大小、部位、種類、培養基成分、激素水平和培養條件等因素都會影響褐化的發生[3]。在緩解植物組織培養褐化的措施中，除了選擇適宜的外植體及培養基外，多采用抗氧化劑或吸附劑處理，常用的抗氧化劑和吸附劑有抗壞血酸、檸檬酸、亞硫酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和活性炭等[4-6]。

茶葉中含有較多的易被氧化的多酚類物質，所以在組培過程中外植體容易發生褐化，嚴重時外植體會因褐化而死亡。本文以龍井-43的腋芽為外植體，初步探討了取材季節、外植體類型、不同抗氧化劑和培養溫度對茶樹腋芽初代培養時外植體褐化的影響，以期篩選出較好的防褐化措施，為進一步開展茶樹組織培養提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與外植體的處理

取龍井-43當年生未木質化或半木質化的健壯新梢，采自安徽農業大學農業園。將采集的新梢用流水沖洗掉表面塵土，用0.1%的多菌靈表面清洗，沖洗干凈，室內水培一周。試驗時剪成長約1cm的帶單個腋芽的莖段，在無菌操作條件下，先用75%酒精消毒約8s，無菌水漂洗3次，再用0.1% HgCl2+0.1%吐溫-20在100rpm搖床上消毒8～9min，無菌水漂洗數次。消毒后的材料約10個分置在無菌的培養皿中，進行接種。

1.2 培養基及培養條件

采用1/2 MS為基本培養基，附加BA 2.0 mg·L-1+ IBA 0.1 mg·L-1+ GA33.0 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂 7.0 g·L-1，滅菌前pH值為5.8。接種后遮光培養7d。光照培養光照周期為16h光照，8h黑暗。培養溫度為25±2℃。

1.3 試驗處理

1.3.1 取材季節

以春季腋芽和秋季腋芽為外植體，研究了不同季節外植體的污染率、褐化率、萌發率。

1.3.2 對外植體褐化的控制

采用春季材料，對外植體的切取方法進行了研究，外植體采用了：Ⅰ.斜切腋芽，不帶莖段和葉；Ⅱ.腋芽帶莖段；Ⅲ.腋芽帶莖段，留少量葉柄三種處理。帶莖段的外植體均是下端斜切，上端平切。

外植體接種于添加不同抗氧化劑的培養基中。各種抗氧化劑的濃度分別為（1）維生素C（Vc）0.5、1.0、2.0 g?L-1；（2）活性炭（AC）0.25、 0.5、1.0 g?L-1；（3）聚乙烯吡咯烷酮（PVP）0.5、1.0、2.0 g?L-1。 此外，外植體接種之前，用2.0 g?L-1PVP溶液（過濾除菌）浸泡30 min，然后接種于未添加抗氧化劑的培養基中。

外植體接種后置于8℃避光培養16h，再置于25℃培養，以始終置于25℃培養為對照。

1.3.3 上述各因素的組合效果

待確定了各因素的最佳抑制褐化效果后，將其組合應用于茶樹腋芽培養，考察各因素的組合對外植體褐化的抑制效果。

以上每個處理均重復3次。

1.4 評價標準與數據統計

腋芽的萌發狀況采用萌動和萌發兩個評價標準。萌動，即腋芽膨大，未展開葉；萌發，即腋芽膨大，繼而形成新梢，有展開葉。外植體接種后4周左右進行萌動率統計，8周左右進行萌發率統計。

污染率、褐化率分別于接種后7d～15d和3d～7d統計。污染率=（污染的外植體/接種的外植體）×100﹪；褐化率=（褐化的外植體/接種的外植體）×100﹪；無污染率=（無污染的外植體/接種的外植體）×100﹪；萌動率=（萌動的外植體/接種的外植體）×100﹪；萌發率=（萌發的外植體/接種的外植體）×100﹪。

2 結果與分析

2.1不同季節外植體的污染率、褐化率、萌發率比較

表1 不同季節外植體污染率、褐化率、萌發率比較

由表1可知：新梢萌發季節即芽的生育狀態對外植體的污染率、褐變率和萌發有很大影響。秋季材料的污染率較高可能是由于腋芽經過了近半年的生長，鱗片較多，潛伏的有害菌較多，外植體表面消毒又很難將其完全殺滅；春季的腋芽生長時間較短，自身帶菌較少，消毒相對容易，所以污染率較秋季低。春季新梢多酚類含量比秋梢低，春季外植體的褐化率相比秋季外植體低；秋季的腋芽可以萌動，但是沒有伸長形成新梢，春季的腋芽萌發后生長較快，部分腋芽16周就可以生長至6cm。

2. 2 外植體切取方法與培養結果的關系

表2 不同類型外植體褐變率、萌發率比較

試驗結果表明（表2），外植體的受傷害程度與褐變程度有較大關系。這主要由于不同的切取方法，留下的傷口面積不同，傷口面積越大，表面消毒劑對外植體傷害越多，褐變程度越重。此外，外植體組織受傷害程度直接影響萌發，腋芽帶莖段留部分葉柄的外植體接種兩周后就開始萌動，葉柄也會逐漸從基部脫落，第8周外植體萌發率可以達到10.5%，而單獨的腋芽萌發率為0。

2. 3 不同抗氧化劑對茶樹腋芽褐化的影響

抗氧化劑抑制褐化的作用在其它植物組培中已有許多報道。我們選用了幾種抗氧化劑和吸附劑加入培養基中，以及使用PVP溶液浸泡外植體（以不加的培養基為對照），結果表明，培養基中加入維生素C（0.5～2.0 g·L-1）、活性炭（0.25～1.0 g·L-1）、聚乙烯吡咯烷酮（0.5～2.0 g·L-1），均可不同程度減少外植體褐化的發生，抑制效果最佳的是使用2.0g·L-1PVP溶液浸泡外植體30min（表3）。

表3 維生素C、活性炭、聚乙烯吡咯烷酮對茶樹腋芽褐變的影響

2. 4 培養溫度對茶樹腋芽褐化的影響

在試驗中發現，把接種后的茶樹腋芽分別在高溫（25℃）和低溫（8℃）條件下培養，高溫培養可明顯促使褐化的發生，褐化率達 38.7%，而低溫條件下褐化率為20.6%。因為高溫能促進多酚氧化酶的生物活性，從而促進多酚類物質的氧化，加速外植體褐化，而低溫可以抑制酚類化合物的合成，降低多酚氧化酶的活性，抑制多酚類氧化，從而減輕外植體褐化。

2. 5 上述因素組合效果的考察

春季茶樹新梢為材料，腋芽帶莖段留少量葉柄為外植體，培養基中不添加任何抗氧化劑和吸附劑。考察外植體接種前在2.0 g·L-1PVP溶液浸泡30min、接種后在8℃條件下避光處理16h對外植體褐化的抑制效果。以外植體直接接種且接種后直接置于25±2℃培養為對照。

試驗結果發現，各因素組合后外植體褐化率為8.9%，對照的褐變率29.3%，外植體的褐化率顯著降低。

3 討論

在影響茶樹腋芽褐化的眾多因素中，本試驗首先對培養材料的生長季節和生理狀態進行了選擇，因為植物的不同生長季節和生理狀態在組織培養中發生褐變的頻率和程度都存在很大的差別。外植體在不進行任何褐化控制的條件下培養，根據培養的結果（表1），篩選出褐化發生輕、污染率低、萌發率高的春季茶樹腋芽作為適宜的培養材料。在參考了茶樹[7,8]、油茶[5]、核桃[4]組織培養方面的研究結果后，確定了1/2MS為基本培養基，附加BA 2.0mg·L-1+ IBA 0.1 mg·L-1+ GA33.0 mg·L-1+ 蔗糖30 g·L-1+ 瓊脂7.0 g·L-1，作為茶樹腋芽初代培養的的培養基。

外植體組織受傷害程度直接影響褐化和萌發（表2），與單獨腋芽的作為外植體相比，腋芽帶莖段留少量葉柄的外植體，其褐化率明顯降低，萌發率也較高。

本試驗通過在培養基中添加不同種類和濃度的抗氧化劑對抑制褐變的效果進行研究，其總體結果為PVP ＞Vc ＞AC，且均比對照好，尤其是接種前使用2.0 g·L-1PVP溶液浸泡外植體30min抑制褐化的效果最佳。這與對油茶[5]和中國李[6]的研究結果較為一致。

在初代培養時把外植體處于不適合酚類合成或降低多酚氧化酶活性的條件下，如在黑暗或弱光及低溫下培養，可抑制多酚類物質的氧化，從而減輕外植體褐化。在“薄殼香”核桃[4]的愈傷組織誘導時，把外植體分別培養在高溫（25±2℃）和低溫（18±2℃）條件下培養，高溫培養褐化率達52.7%，而低溫條件下褐化率為29.8%。油茶莖尖[5]在l0℃恒溫箱中處理3d后再置于（25±2℃）的室內培養，可在一定程度上減輕外植體的褐化反應。

春季材料適宜做腋芽培養，可以降低外植體的污染率與褐變率，提高腋芽萌發率。腋芽帶莖段留部分葉柄、外植體接種前在2.0 g·L-1PVP溶液浸泡30min、接種后在8℃條件下避光處理16h能夠明顯減輕褐化。

[1] 張紅曉,經劍穎.木本植物組織培養技術研究進展[J].河南科技大學學報(農學版),2003,23(3):66～69.

[2] 翟曉巧.木本植物組織培養褐化控制策略[J].河南林業科技,2008,28(1):38～40.

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[4] 劉蘭英.薄殼香核桃組培中的褐化及防止措施研究[J].園藝學報,2002,29(2):171～172.

[5] 闕生全,彭凌,朱必鳳,等.油茶組織培養過程中防止褐變的研究[J].韶關學院學報(自然科學版), 2006,27(3) : 67～69.

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[7] 周健,成浩,王麗鴛.茶葉組培快繁技術的優化研究[J].茶葉科學,2005,25(3) :172～176．

[8] Mondal TK, Bhattacharya A, Laxmikumaran M, Ahuja PS. Recent advances of tea (Camellia sinensis) biotechnology[J]. Plant Cell Tiss Org Cult, 2004, 76: 195～254.

S336

A

1006-5768(2010)03-0101-04

2010-05-06

雷攀登（1983- ），男，安徽蕭縣人，碩士研究生，研究方向：茶葉生物化學及天然產物研發。*

zzz@ahau.edu.cn。