轉(zhuǎn)移抑制與metastamiR調(diào)節(jié)的聯(lián)系

王偉強 李書軍 翻譯 丁燕 南娟 校對

天津醫(yī)科大學總醫(yī)院，天津市肺癌研究所，天津市肺癌轉(zhuǎn)移與腫瘤微環(huán)境重點實驗室

癌癥轉(zhuǎn)移需要轉(zhuǎn)移級聯(lián)的各個步驟中多個基因的協(xié)調(diào)表達。調(diào)節(jié)這些遺傳程序的分子可能在多個水平上影響轉(zhuǎn)移。乳腺癌轉(zhuǎn)移抑制因子1（BRMS1）通過調(diào)節(jié)許多蛋白質(zhì)編碼的、轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因以及轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)小分子RNA（術(shù)語為metastamiR）來抑制級聯(lián)中的多個步驟進而抑制轉(zhuǎn)移。在此專題中，我們將重點闡述BRMS1的生物學特性與metastamiR調(diào)節(jié)之間的聯(lián)系。

引言

癌癥轉(zhuǎn)移的形成需完成幾個步驟，且每個步驟均為不同的且高度協(xié)調(diào)的遺傳程序。轉(zhuǎn)移中的每一步均是限速的，這意味著任何一步受阻，腫瘤細胞即不能進展至下一步。轉(zhuǎn)移抑制因子是一組基因產(chǎn)物，根據(jù)定義，它們可阻斷轉(zhuǎn)移，但不能阻止原發(fā)腫瘤的形成，并有可能成為干預(yù)癌細胞最致命特性——轉(zhuǎn)移的靶點[1-4]。BRMS1轉(zhuǎn)移抑制因子主要通過改變SIN3：組蛋白去乙酰化酶（HDAC）染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合體來調(diào)節(jié)多個轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，進而抑制轉(zhuǎn)移級聯(lián)的多個步驟[5-8]。另外，BRMS1可協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)多個metastamiR（轉(zhuǎn)移相關(guān)小分子RNA），包括上調(diào)轉(zhuǎn)移抑制miRNA以及下調(diào)轉(zhuǎn)移促進miRNA[9]。

小分子RNA（miRNA）是一類非編碼RNA基因[10-12]。miRNA主要在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因表達。miRNA基因主要由RNA聚合酶II進行轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄時形成一個典型的發(fā)卡樣結(jié)構(gòu)（pri-miRNA）。RNAse III Drosha連同共同因子DiGeorge綜合征關(guān)鍵區(qū)域基因8（DGCR8），可以識別并剪切發(fā)卡結(jié)構(gòu)，并生成pre-miRNA轉(zhuǎn)運至細胞漿。Dicer酶和其它核糖核蛋白可進一步使發(fā)卡結(jié)構(gòu)形成成熟的約22個核苷酸的miRNA，miRNA與RNA誘導沉默復(fù)合體（RISC）結(jié)合后，可靶向作用于mRNA的3'UTR，進而調(diào)節(jié)翻譯[13,14]。鑒于成熟的miRNA序列短，特定的miRNA理論上可靶向作用于數(shù)以百計的mRNA，因此miRNA為許多正常和病理細胞過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。miRNA在哺乳動物細胞中被發(fā)現(xiàn)后不久，在癌癥中也發(fā)現(xiàn)了miRNA的調(diào)節(jié)異常。在慢性淋巴細胞白血病中miR-15/16有頻繁下調(diào)或缺失[15]。之后，有研究發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)癌癥中miRNA既有促癌作用，也有抑癌作用[16]。新近，研究發(fā)現(xiàn)數(shù)個miRNA在不依賴原發(fā)腫瘤發(fā)生的情況下即可調(diào)節(jié)癌轉(zhuǎn)移過程[17]。

兩篇新近論文促使作者撰成本篇短評。首先，BRMS1可上調(diào)轉(zhuǎn)移抑制性miR-146a/b的表達，而miR-146a/b單獨即可抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移[18]。其次，BRMS1可協(xié)同調(diào)節(jié)多個metastamiR的表達[9]。在這篇綜述中，我們將回顧已知的BRMS1的metastamiR靶點以及BRMS1的這些功能如何與已知的BRMS1的生物學作用相一致。

BRMS1調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因

采用微細胞介導染色體轉(zhuǎn)移技術(shù)將11號染色體轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞可抑制轉(zhuǎn)移，由此發(fā)現(xiàn)了BRMS1[19]。緊隨此項研究，采用差異顯示雜交技術(shù)鑒定出了差異表達基因[20]。利用這些分析， 全長的BRMS1被克隆。當BRMS1轉(zhuǎn)染至轉(zhuǎn)移性細胞中時，原位乳腺癌、黑色素瘤和非小細胞肺癌仍能繼續(xù)生長，但它們的轉(zhuǎn)移能力下降[20-24]。

有關(guān)生物學機制，我們及其他研究者均發(fā)現(xiàn)BRMS1可改變轉(zhuǎn)移的不同步驟所需的幾種組分：恢復(fù)縫隙連接的細胞間信息交流[25]、促進失巢凋亡[22]、抑制在軟瓊脂中的生長[20,26]及轉(zhuǎn)移/侵襲[22,23,26]。在分子水平上，當BRMS1重新表達時，可改變轉(zhuǎn)錄組[27]和蛋白質(zhì)組[28,29]。這些變化包括（但不僅局限于此）：表皮生長因子受體（EGFR;[8,30]）、骨橋蛋白（OPN;[8,31-33]）、尿激酶型纖溶酶原激活劑（uPA;[34,35]）、C-X-C趨化因子受體4（CXCR4;[36]）和成束蛋白（fascin）[37]。研究認為這些改變主要是由于BRMS1與SIN3:HDAC染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合體之間的相互作用[5-8,38]。總之，BRMS1轉(zhuǎn)移抑制機制的假說認為BRMS1是轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達的表觀遺傳學調(diào)節(jié)因子。

MetastamiR—miRNA功能的新發(fā)現(xiàn)

我們猜想，BRMS1除了調(diào)控轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白編碼基因外，也可調(diào)控包括miRNA在內(nèi)的非編碼基因。利用miRNA雜交技術(shù)，研究發(fā)現(xiàn)BRMS1可調(diào)節(jié)miRNA的一個亞組，此亞組中的數(shù)個miRNA可被稱為metastamiR。有趣的是，通常當促進轉(zhuǎn)移的metastamiR減少時，抑制轉(zhuǎn)移的metastamiR往往會增多[9]。

Ma,Weinberg及其同事首次發(fā)現(xiàn)并報道了一種metastamiR-miR-10b的存在[39]。miR-10b可促進離體與在體的腫瘤細胞侵襲，且不影響腫瘤細胞的生存或增殖。重要的是，促進了在體的轉(zhuǎn)移（備注：離體的轉(zhuǎn)移無法被測量；僅可應(yīng)用體外實驗來模擬參與轉(zhuǎn)移的步驟）。其它促轉(zhuǎn)移metastamiRs亦已被體內(nèi)功能數(shù)據(jù)證實，包括：miR-21，-143， -182，-373和520c[40]。

miR-143和-182可分別促進肝細胞癌和黑色素瘤的轉(zhuǎn)移[41,42]。miR-143可通過NFκB上調(diào)其表達，并可降低細胞間粘附。miR-182可促進體內(nèi)遷移，且是位于染色體7q31-q34上的部分microRNA簇，此外，microRNA簇還包括miR-96和miR-183（miR-183-96-182）。在晚期人黑色素瘤中，這一區(qū)域擴增頻繁[43]，這進一步支持此microRNA簇在浸潤行為中的作用。有趣的是， 此microRNA簇與人進行性聽力喪失有關(guān)[44,45]。

對理解miR-182在控制癌細胞行為中作用的重要的補充是，miRNA基因常位于染色體的近端。miRNA簇在基因上相互連接，通過一個共同的啟動子頻繁轉(zhuǎn)錄，并可產(chǎn)生多順反子初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物[46]。因此，單個microRNA在協(xié)同網(wǎng)絡(luò)中表達，這意味著單個microRNA與其它microRNA的共同表達使得分析microRNA簇中單個的microRNA的功能復(fù)雜化。因此，在癌癥中，當對miR-182進行單獨檢測時， miR-96和-183可能也參與到其中。然而，據(jù)我們所知，目前尚無人采用功能分析的方法對任一microRNA簇的單體和/或聯(lián)合功能進行系統(tǒng)的研究。我們認為這些分析對確定microRNA在癌癥生物學中的作用至關(guān)重要。

miR-21可促進侵襲和遷移，同時減少凋亡。采用antagomir[47]短暫性敲除miR-21可顯著降低乳腺癌和結(jié)直腸癌細胞向肺的實驗性轉(zhuǎn)移[48]。利用miRNA表達數(shù)據(jù)庫，通過對轉(zhuǎn)導有非轉(zhuǎn)移性MCF7的人乳腺癌細胞進行高通量分析，鑒定出了miR-373和-520c。應(yīng)用transwell遷移實驗篩選轉(zhuǎn)導子發(fā)現(xiàn)，miR-373和-520c是體外遷移和侵襲的促進因子[49]。實驗性轉(zhuǎn)移檢測進一步顯示miR-373和-520c均為真正的metastamiR，因為它們可促進腫瘤轉(zhuǎn)移至多個部位。

另一類metastamiR可抑制轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移抑制metastamiR包括：miR-31[50]， -146a/b[18]，-206[51]和 -335[51]。許多研究小組發(fā)現(xiàn)miR-146在炎癥中起作用[52-55]。miR-146a和b均可抑制乳腺癌細胞侵襲和遷移，其機制可能是通過靶向作用于IRAK1和TRAF6而下調(diào)NFκB[53]。miR-146a/b通過促進侵襲和轉(zhuǎn)移的EGFR[18]和/或信號分子ROCK1[56]的表達，可進一步降低癌細胞的轉(zhuǎn)移潛能。擴展至體內(nèi)的這些研究顯示miR-146a和b均可抑制乳腺癌細胞系中的實驗性轉(zhuǎn)移[18]。

miR-206和-335是首先被鑒定的抑制性metastamiR。Tavazoie等比較了源于人乳腺癌細胞系MDA-MB-231的各轉(zhuǎn)移性變異體中miRNA的表達[51]。在轉(zhuǎn)移性變異體中有6個特定miRNA的表達同時處于低水平。其中3個metastamiR——miR-335、-126和-206，可抑制轉(zhuǎn)移；而miR-126也可抑制細胞增殖和腫瘤發(fā)生。因此，只有miR-335和-206可被歸類為轉(zhuǎn)移抑制因子。miR-335和-206抑制轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟是抑制侵襲和遷移。

盡管大部分metastmiRs似乎在腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，但迄今為止只有1個metastmiR被證明在轉(zhuǎn)移級聯(lián)的多個步驟中起作用。最近有報道稱miR-31可抑制細胞侵襲、促進失巢凋亡并抑制異位定殖[50]，并使原位乳腺癌模型的肺轉(zhuǎn)移減少95%，同時依然允許原位生長。通過基因個體發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)， miR-31可抑制卷曲蛋白3 （Fzd3）、整合素α-5（ITGA5）、肌球蛋白磷酸酶-Rho-相互作用蛋白（M-RIP）、基質(zhì)金屬蛋白酶 16（MMP 16）、根蛋白（RDX）和RhoA。

我們認為，更多microRNA的表達與腫瘤的浸潤、侵襲、轉(zhuǎn)移和存活相關(guān)。然而，我們的討論僅限于體內(nèi)功能數(shù)據(jù)已發(fā)表且對轉(zhuǎn)移具有選擇性調(diào)節(jié)作用的microRNA。無疑，metastamiR的數(shù)量還會繼續(xù)增加。

盡管每一metastamiR均存在多個靶點，但最終結(jié)果皆為轉(zhuǎn)移的增多抑或是減少。有趣的是，已知的轉(zhuǎn)錄抑制因子BRMS1，既可增加轉(zhuǎn)移抑制metastamiR的表達又可降低轉(zhuǎn)移促進metastamiR的表達。BRMS1如何協(xié)同調(diào)節(jié)如此眾多的轉(zhuǎn)移相關(guān)的遺傳過程，目前仍不明了。許多metastamiR可能通過數(shù)量有限的信號通路聯(lián)系起來，而BRSM1通過直接和間接的機制來調(diào)節(jié)它們的表達。

在多個水平上調(diào)節(jié)的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)移信號通路

MetastamiR和轉(zhuǎn)移抑制因子均可作用于轉(zhuǎn)移級聯(lián)的特定步驟。已有研究證實有11個miRNA可促進或阻斷轉(zhuǎn)移。這一數(shù)量有可能增加，因為已發(fā)現(xiàn)至少有20多個miRNA可影響轉(zhuǎn)移的所有重要步驟，如上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、細胞凋亡與血管生成。BRMS1是第一個被發(fā)現(xiàn)的可調(diào)節(jié)miRNA的轉(zhuǎn)移抑制因子。同樣，25個其它轉(zhuǎn)移抑制因子中的一部分亦可能直接或間接影響metastamiR的表達。

更有意義的是BRMS1和miR-31間的相似性。兩者均可阻斷轉(zhuǎn)移級聯(lián)的多個步驟；兩者均可阻斷異位定殖；以及兩者均可改變幾種轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達和信號通路。

這些發(fā)現(xiàn)連同有關(guān)miRNA和轉(zhuǎn)移相關(guān)級聯(lián)反應(yīng)的文獻的大量出現(xiàn)，促使我們將這一綜述的重點擴展至這一領(lǐng)域的發(fā)展現(xiàn)狀。而且，幾項臨床研究已發(fā)現(xiàn)miRNA的表達與復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的發(fā)展和/或生存之間存在相關(guān)性[57]。因此，我們的目的是關(guān)注轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)小分子RNA（metastamirs）的證據(jù)、其存在的意義以及它們的發(fā)現(xiàn)過程中呈現(xiàn)的一些技術(shù)和理論的思索。

miR-10b最終通過激活RhoC[39]對轉(zhuǎn)移起正性調(diào)節(jié)作用，RhoC在BRMS1細胞中的表達也下降[9]。BRMS1、miR-10b與RhoC之間的聯(lián)系值得深思；然而，我們在闡述其間關(guān)系時仍需謹慎。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化誘導轉(zhuǎn)錄因子TWIST1，是miR-10b的正性調(diào)節(jié)因子。表達BRMS1的細胞可下調(diào)TWIST1和miR-10b的表達。由于TWIST1和miR-10b啟動子仍未完全被鑒定，目前無法確定BRMS1是僅作用于TWIST1還是作用于TWIST1和miR-10b。

同樣， 參與miR-10b級聯(lián)的數(shù)個分子同時受BRMS1的調(diào)節(jié)。例如，EGFR通過Jak/stat信號（不依賴Erk/MEK信號T）可刺激TWIS進而引起EMT[58]。BRMS1可直接（通過降低受體表達）和間接（通過減弱磷酸肌醇信號）下調(diào)EGF信號[30]。EGFR表達和TWIST-miR-10b-RhoC軸的降低可能是BRMS1調(diào)節(jié)miR-146a/b的結(jié)果，miR-146a和miR-146b均可靶向作用于EGFR[18]。

我們以及來自多個其它實驗室的數(shù)據(jù)均清晰顯示BRMS1對轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)是多層次的。在細胞內(nèi)對基因的直接及間接作用都是可操控的。BRMS1可以在轉(zhuǎn)錄水平或通過一種轉(zhuǎn)錄中間體直接改變基因表達（如：通過改變轉(zhuǎn)錄因子的表達，像TWIST）。同時，BRMS1也可通過如上所述的調(diào)控轉(zhuǎn)錄或通過改變miRNA的表達而減少翻譯以調(diào)節(jié)蛋白表達。

結(jié)論

對多細胞機體來說，最重要的是細胞不會遷移至其它部位并與其它組織整合。那樣會造成混亂并破壞動態(tài)平衡。失效的安全冗余（fail safe redundancies）似乎可成為控制癌轉(zhuǎn)移的通路。但是，這一冗余的出現(xiàn)需付出代價。盡管我們對癌轉(zhuǎn)移研究所呈現(xiàn)的成果已初步形成復(fù)雜的轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)系統(tǒng)，但我們的發(fā)現(xiàn)（連同許多其它實驗室的發(fā)現(xiàn)）同時又提出了如下幾個問題：

·為什么細胞可產(chǎn)生多個調(diào)節(jié)因子以操控單個分子？在不同的作用機制和分子之間存在什么類型的相互作用？

·為什么細胞可產(chǎn)生具有眾多靶點的單個分子（像miRNA）？是否存在特異性的靶點？是否還有其它共同因子參與？miRNA表達的化學計量學是否重要？

·metastamiR是否會成為有用的臨床治療靶點？如果會，miRNA的混亂會造成更多還是更少的脫靶效應(yīng)？

·是否所有的轉(zhuǎn)移抑制因子均可改變metastamiR的表達？轉(zhuǎn)移抑制因子“通路”中是否存在重疊現(xiàn)象？

·外源miRNA與內(nèi)源miRNA是否有相似的作用？當某一miRNA存在于簇中時，人為再引入單個miRNA是否會產(chǎn)生生物學效應(yīng)？或者是否應(yīng)該對miRNA進行成對的（或更有序的）研究？

·在轉(zhuǎn)移中pri-miRNA和pre-miRNA是否也起作用？

·miRNA （metastamiR）以及轉(zhuǎn)移抑制因子和/或促進因子的反饋機制是什么？

致謝

基金資助：USPHS基金 CA87728（D.R. Welch）和F32CA113037（D.R. Hurst）；美國陸軍醫(yī)學研究和裝備司令部W81-XWH-08-1-0786（M.D. Edmonds）提供的博士獎學金；國家腫瘤研究基金會和腫瘤轉(zhuǎn)移研究中心（D.R. Welch）。

由于篇幅有限，在此我們向相關(guān)工作未被引用的作者表示歉意。