宮頸癌中Eag1鉀離子通道的表達(dá)以及缺氧對其的調(diào)控作用*

林 爽,李 力,易 萍,鄭秀惠,郭建新,韓 健

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所婦產(chǎn)科,重慶 400042)

宮頸癌中Eag1鉀離子通道的表達(dá)以及缺氧對其的調(diào)控作用*

林 爽,李 力△,易 萍,鄭秀惠,郭建新,韓 健

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所婦產(chǎn)科,重慶 400042)

目的研究不同病變宮頸組織中Eag1表達(dá)情況以及缺氧對宮頸癌Hela細(xì)胞膜上Eag1鉀離子通道表達(dá)的影響。方法采用免疫組化、免疫熒光和RT-PCR法,檢測不同病變宮頸組織和宮頸癌Hela細(xì)胞中Eag1蛋白的表達(dá)情況,以及不同缺氧時間和缺氧濃度對Hela細(xì)胞中Eag1 mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果免疫組化結(jié)果表明,宮頸上皮內(nèi)瘤變組織中Eag1蛋白的表達(dá)明顯高于正常組,宮頸癌組織中Eag1的表達(dá)明顯高于宮頸上皮內(nèi)瘤變組;Eag1的表達(dá)隨臨床分期的增高而增加;與病理分級無明顯相關(guān)性。免疫熒光、RT-PCR結(jié)果表明,正常培養(yǎng)的宮頸癌Hela細(xì)胞中即有Eag1表達(dá);其表達(dá)隨缺氧程度加深及缺氧時間的延長明顯增強(qiáng)。結(jié)論Eag1鉀離子通道蛋白有可能成為新的早期篩查和判斷宮頸癌生物學(xué)行為的診斷指標(biāo)。Eag1在宮頸癌Hela細(xì)胞缺氧感受中起重要的作用。

宮頸癌;鉀離子通道;Eag1

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤,雖然目前診療技術(shù)有了較大的提高,但仍有30%～40%的患者死于局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。最近有關(guān)離子通道與低氧適應(yīng)之間的關(guān)系引起了越來越多的注意[1]。有研究認(rèn)為膜Eag1鉀離子通道宮頸癌的相關(guān)性最為密切[2]。但目前Eag1在宮頸癌組織中的表達(dá)情況仍需進(jìn)一步證實。本研究以不同病變宮頸組織和體外培養(yǎng)的人宮頸癌Hela細(xì)胞為研究對象,通過研究Eag1鉀離子通道在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的表達(dá)情況以及缺氧對Eag1鉀離子通道表達(dá)的影響,以期為宮頸癌的診治提供新的途徑。

1 資料與方法

1.1 一般資料 標(biāo)本全部來自本院婦產(chǎn)科1995年12月至2008年12月診治的病例,全部標(biāo)本均經(jīng)本院病理科診斷并證實。選取慢性宮頸炎20例,宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)40例(CINⅠ15例,CINⅡ10例,CINⅢ15例),宮頸鱗癌80例,共計140例。患者年齡24～77歲,平均 46歲。

1.2 細(xì)胞缺氧模型的準(zhǔn)備 觀察細(xì)胞70%～90%融合,細(xì)胞貼壁形態(tài)良好。在無菌條件下棄去大部分培養(yǎng)液,剩余培養(yǎng)基僅可將細(xì)胞覆蓋,以減少氣體彌散距離。將各組細(xì)胞同時置于密閉容器,將混合氣體(含 90%N2、5%CO2、5%O2)以 10 L/min流量充入密閉容器,持續(xù)20 min,同時關(guān)閉進(jìn)氣口和出氣口,抽取氣體經(jīng)血?dú)夥治鰞x檢測容器內(nèi)O2濃度小于5%。

1.3 Eag1表達(dá)的檢測

1.3.1 免疫組化檢測方法 兔抗人Eag1單克隆抗體購自sigma公司。組織標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋,制成4 μ m厚切片,常規(guī)脫蠟,30%新鮮雙氧水滅活內(nèi)源酶,將切片浸入0.01 M枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0),微波爐加熱至沸后斷電,間隔10 min重復(fù)2次,冷卻后0.02 M PBS洗滌,抗原修復(fù)液修復(fù)抗原,山羊血清封閉后不洗,滴加1∶150稀釋的Eag1單克隆抗體,4℃過夜,0.02 M PBS洗后加生物素標(biāo)記羊抗兔二抗,30℃染色20 min后,DAB顯色,蘇木素輕度復(fù)染,二甲苯透明,封片。顯微鏡下觀察并計數(shù)陽性染色細(xì)胞數(shù)。

1.3.2 免疫熒光檢測方法 對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞接種于裝有載玻片的無菌培養(yǎng)皿中,95%乙醇室溫固定30 min。加0.3%TritonX-100室溫 10 min;PBS洗3次,每次10 min;正常山羊血清37℃封閉10 min,吸去不洗;加兔抗人單克隆抗體Eag1(1∶100),4℃孵育;PBS洗3次,每次10 min;加羊抗兔IgG-FITC(1∶100),37℃孵育2 h;PBS洗 3次,每次10 min;熒光顯微鏡觀察照相。

1.3.3 判斷標(biāo)準(zhǔn) Eag1主要定位于胞漿和(或)胞膜。根據(jù)腫瘤細(xì)胞顯色的比例及染色強(qiáng)度,對Eag1表達(dá)作半定量評定[3]。按陽性細(xì)胞率評分:陽性細(xì)胞數(shù)小于 11%為 1分;11%～50%為2分;51%～80%為3分;大于 80%為4分。按顯色程度評分:染色弱為1分;中等染色為2分;強(qiáng)染色為3分。然后將2種評分結(jié)合起來分為4級:無論染色強(qiáng)度如何,細(xì)胞陽性率小于或等于10%為陰性;評2～3分者為弱陽性(+);評4～5分者為中度陽性(++);6～7分者為強(qiáng)陽性(+++)。若1例標(biāo)本有2個染色結(jié)果,則取1個納入統(tǒng)計。

1.4 RT-PCR法檢測Eag1 mRNA表達(dá) Trizon試劑盒購自Invitrogen公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司。Eag1引物為 :5′-TAA TGG CT T CCC TCT T TC ATC TCC T-3′;5′-TGT TGA GAC TCC TCC ATT CCT TCC A-3′(450 bp);βactin 引物為 :5′-CAC GGC TGC TTC CAG CTC CT-3′;5′-CTC CTG CT T GCT GAT CCA CAT C-3′(150 bp)。 取(0.5～1)×107細(xì)胞,按 Tripil試劑盒說明提取總 RNA,按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),Eag1 mRNA的PCR反應(yīng)條件為94℃變性30 s,58℃Eag1退火30 s,72℃2 min,最后72℃延伸2 min。瓊脂糖電泳測定Eag1 mRNA表達(dá),拍照。每一組檢測6瓶細(xì)胞。

2 結(jié) 果

2.1 Eag1蛋白在不同宮頸病變中的表達(dá)

2.1.1 Eag1在慢性宮頸炎、CIN及宮頸鱗癌中的表達(dá) Eag1在3種組織中均為細(xì)胞漿、胞膜表達(dá),細(xì)胞核未見表達(dá)。Eag1在慢性宮頸炎及CIN中呈輕度著色,Eag1在宮頸鱗癌中呈中強(qiáng)度著色,陽性信號彌漫分布于癌巢內(nèi)(插頁Ⅰ圖 1～3)。Eag1在宮頸鱗癌中的表達(dá)率明顯高于慢性宮頸炎組和CIN組,CIN組內(nèi)Eag1表達(dá)率明顯高于慢性宮頸炎組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01),結(jié)果見表1。

2.1.2 Eag1在各級CIN中的表達(dá) Eag1在C1N各級之中的表達(dá)隨病變程度的增高逐漸增高,但各組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),見表 2。

表1 Eag1在慢性宮頸炎、CIN和宮頸癌組織中的表達(dá)

2.1.3 Eag1表達(dá)與宮頸癌臨床病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系 Eag1在不同病理分級中的陽性表達(dá)率雖然隨病變惡性程度的增高逐漸增高,但各組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。在不同的臨床期中,Ⅰ+Ⅱ期組 Eag1表達(dá)明顯高于0期(P＜0.01),而Ⅲ+Ⅳ期組Eag1表達(dá)明顯高于Ⅰ+Ⅱ期組和0期組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01),結(jié)果見表3。

表2 Eag1在各級CIN中的表達(dá)

表3 Eag1表達(dá)與宮頸癌臨床分期、病理分級的關(guān)系

圖5 不同缺氧條件下宮頸癌Hela細(xì)胞中Eag1 mRNA水平變化

2.2 Eag1蛋白在Hela細(xì)胞的表達(dá) 本科選擇宮頸癌Hela細(xì)胞株,采用間接免疫熒光法檢測細(xì)胞內(nèi)Eag1蛋白的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)Eag1蛋白主要集中在細(xì)胞膜上及胞漿中(插頁Ⅰ圖4)。

2.3 缺氧對Eag1 mRNA表達(dá)的影響 采用RT-PCR法檢測了Eag1 mRNA在不同缺氧條件下宮頸癌Hela細(xì)胞系的表達(dá)情況,給予不同缺氧條件,3 h后Hela細(xì)胞中其mRNA的表達(dá)水平不盡相同,隨缺氧程度的增加呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(圖5);在5%氧濃度條件下,其表達(dá)隨缺氧時間的增加逐漸增高,見圖 6。

圖6 不同缺氧時間下宮頸癌Hela細(xì)胞中Eag1 mRNA水平變化

3 討 論

宮頸癌是婦科三大惡性腫瘤之一。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)部乏氧不僅可引起腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,還可引起腫瘤細(xì)胞放化療抵抗,但其具體的缺氧調(diào)控機(jī)制仍不十分清楚。最近有關(guān)離子通道與低氧適應(yīng)之間的關(guān)系引起了越來越多的注意[3-4]。離子通道中最常與細(xì)胞增殖和腫瘤相關(guān)的是鉀通道;其中膜Eag1鉀離子通道被認(rèn)為與宮頸癌的相關(guān)性最為密切。

Eag1鉀離子通道是1969年發(fā)現(xiàn)的一種新的通道,屬電壓門控性鉀通道,通過去極化而激活。專一分布于大腦,在肌細(xì)胞和胎盤中有少量表達(dá)[5-6]。Eag表達(dá)和激活在多種腫瘤細(xì)胞株和重要的腫瘤組織中被證實。Fatias等[7]通過對6例宮頸癌組織標(biāo)本和12例正常宮頸組織進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR和Southern印跡實驗,發(fā)現(xiàn)6例宮頸癌標(biāo)本Eag1表達(dá)全部為陽性,而正常對照標(biāo)本的陽性率僅為33%。作者認(rèn)為Eag1表達(dá)的升高可能是腫瘤發(fā)生的早期信號,Eag1鉀離子通道不僅可以作為腫瘤標(biāo)志物、疾病早期標(biāo)志,也將成為潛在的宮頸癌治療靶點(diǎn)。Faris等[8]的研究也有相似發(fā)現(xiàn),認(rèn)為 Eag1鉀離子通道的表達(dá)與否及其通道活性大小對癌細(xì)胞的增殖非常重要,認(rèn)為其可能成為潛在的宮頸癌細(xì)胞膜上的治療靶點(diǎn),但是上述研究均未從Eag1的表達(dá)情況與宮頸癌臨床分期、病理組織類型等方面進(jìn)行分析,因此,Eag1與宮頸癌之間的相關(guān)性仍需進(jìn)一步研究。

本研究在應(yīng)用FIGO分期的基礎(chǔ)上,采用免疫組化法檢測不同宮頸組織中Eag1蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示,在CIN組織中Eag1的表達(dá)明顯高于慢性宮頸炎組,而宮頸癌組織中Eag1的表達(dá)又明顯高于CIN組,Eag1表達(dá)隨臨床分期升高顯著增高,說明在宮頸癌的生長過程中,Eag1鉀離子通道與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。并且隨著腫瘤向深層生長,Eag1表達(dá)水平更高,推測腫瘤生長過速,缺氧加重,激活更多的基因表達(dá),更能增加它在胞內(nèi)的水平。本實驗結(jié)果顯示,Eag1的表達(dá)水平隨病理分級的升高而升高,但各組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。分析其原因,考慮為不同病理分級的腫瘤組織中均有不同程度的低氧區(qū)域所致。本研究的間接免疫熒光結(jié)果也顯示,在正常培養(yǎng)的Hela細(xì)胞內(nèi)可以檢測到明顯的綠色熒光,證明其中有Eag1蛋白表達(dá)。

隨著對Eag1結(jié)構(gòu)和功能的深入研究,發(fā)現(xiàn)Eag1通道形成的四聚體中,每一個單體有6個假定的主要包含電壓傳感蛋白的跨膜區(qū)(富含正電荷氨基酸)[9],并且它的細(xì)胞內(nèi)側(cè)端有一個PAS區(qū)即為氧感受器,它可根據(jù)氧分壓PO2的變化調(diào)節(jié)自身電導(dǎo)系數(shù),推測其與腫瘤乏氧有關(guān)[10]。

采用RT-PCR法檢測不同氧濃度下 Hela細(xì)胞內(nèi)Eag1 mRNA水平情況,結(jié)果顯示隨氧濃度的降低,Eag1 mRNA水平呈先升高后降低的趨勢,輕度缺氧條件下,缺氧作用0.5 h時細(xì)胞內(nèi)Eag1 mRNA水平即開始升高,3 h后達(dá)高峰,6 h后盡管有所減弱,但仍強(qiáng)于常氧條件下,提示隨缺氧程度加深及時間的延長,Eag1 mRNA水平明顯增強(qiáng)。

[1] Camacho J,Saá nchez A,Pardo LA,et al.Cytoskeletal interactions determine the electrophysiological properties of human EAG potassium channels[J].Pflugers Arch,2000,441(2):167.

[2] Wang G,Jiang B,Rue E,et al.Hypoxia-inducible factor 1 is a basic helix loop helix PAS heterodimer regulated by cellular O2tension[J].Proc Natl Acad Sci USA,1995,92(12):5510.

[3] Clifford SC,Astuti D,Hooper L,et al.The pVHL-associated SCF ubiquitin ligase complex:molecular genetic analysis of elongin B and C,Rbxl and HIF-1 alpha in renal cell carcinomal[J].Oncogene,2001,20(36):50672.

[4] Kung A,Zabludoff S,France D,et al.Small molecule blockade of transcriptional coactivation of the hypoxia-inducible factor pathway[J].Cancer Cell,2004,6(1):33.

[5] Swinson DE,Jones JL,Cox G,et al.Hypoxia-inducible factor-1 alpha in non small cell lung cancer:relation to growth factor,protease and apoptosis pathways[J].Int J Cancer,2004,111(1):43.

[6] Kelly BD,Hackett SF,Hirota K,et al.Cell type-specific regulation of angiogenic growth factor gene expression and induction of angiogenesis in nonischemic tissue by a constitutively active form of hypoxia-inducible factor 1[J].Circ Res,2003,11(93):1074.

[7] Fatias L,Deysi B,Lorenza D,et al.Ether a′go-go potassium channels as human cervical cancer markers[J].Cancer Res,2004,64(1):6996.

[8] Faris L,Ocana D,Diaz L,et al.Overexpression of Eag1 potassium channels in clinical tumours[J].Mol Cancer,2006,5(19):596.

[9] Zhong H,Semenza GL,Simons JW,et al.Up-regulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha is an early event in prostate carcinoma[J].Cancer Detect Prev,2004,28(2):88.

[10]Karni R,Dor Y,Keshet E,et al.Activated pp60c-src leads to elevated hypoxia-inducible factor(HIF)-1alpha expression under normoxial[J].J Biol Chem,2002,277(45):42919.

Expression of Eag1 K+channel in cancer of the cervix and the regulation of hypoxia*

LIN Shuang,LI Li△,Y I Ping,et al.

(Department of Obstreics and Gynecology,Daping Hospital,the Third Military University,Chongqing400042,China)

ObjectiveImmunohistochemistry was employed to detect the expression of Eag1 protein in different cervix uteri tissues and CACX Hela cells.MethodsWe determined the effects of different hypoxia time and hypoxic concentration on the expression of Eag1 mRNA in Hela cell by using RT-PCR.ResultsThe expression of Eag1 protein in cervical intraepithelial neoplasia(CIN)tissue was significantly higher than that in normal control group,and the expression in CACX tissue was remarkably higher than that in CIN group.The expression of Eag1 ascended as the development of clinical stage of cervical cancer,but almost irrelevant to pathological grade.Resultsof immunofluorescence and RT-PCR suggested that the expression of Eag1 significantly increased along with the aggravation of hypoxic degree and prolong of hypoxia time.ConclusionEag1 K+channel protein is possible to become diadynamic criteria for new early screening and CACX biological behavioral judgment.Meanwhile,Eag1 plays an important role in hypoxic reception of CACX Hela cell.

cervical cancer;potassium channels;Ether à-go-go

R737.33;R730.43

A

1671-8348(2010)08-0899-03

國家衛(wèi)生部課題資助項目(WKJ2007-3-001)。△

。

2009-08-14

2009-09-08)