小鼠早期胚胎幾種不同培養方法的比較

丁 芳,李志英,周紅林,楊世華

(1.三峽大學仁和醫院婦產科,湖北宜昌443001;2.昆明醫學院第二附屬醫院婦科,昆明650101;3.中科院昆明動物所,昆明650223)

小鼠早期胚胎幾種不同培養方法的比較

丁 芳1,李志英1,周紅林2△,楊世華3

(1.三峽大學仁和醫院婦產科,湖北宜昌443001;2.昆明醫學院第二附屬醫院婦科,昆明650101;3.中科院昆明動物所,昆明650223)

目的 探討小鼠胚胎體外發育中的最佳培養方案。方法 將從超排的 ICR雌鼠輸卵管內收集的1-細胞放入無糖CZB中培養,分別于2-細胞、4-細胞、桑椹胚階段更換入含3.0 mmol/L葡萄糖(最適濃度)的CZB中,以及胚胎培養全程均在含糖CZB中更換1次培養液、胚胎培養全程均在含糖CZB中不更換培養液,對照組胚胎培養全程均在無糖CZB中,觀察記錄胚胎的發育情況。結果 2-細胞、4-細胞階段換入含糖CZB中的序貫培養及培養全程在含糖CZB中單一培養,囊胚率均高于對照組(P＜0.05);桑椹胚階段換入含糖CZB中的序貫培養,囊胚率與對照組差異無統計學意義(P＞0.05);2-細胞、4-細胞階段換入含糖CZB中的序貫培養與全程在含糖CZB中的兩步法單一培養及一步法單一培養,囊胚率分別為46.5%、38.4%、41.7%、56.6%,其差異無統計學意義(P＞0.05)。結論 在小鼠早期胚胎體外發育中,2-細胞至桑椹胚前對葡萄糖存在依賴性;盡管序貫培養是有效的,但并不一定優于一步單一培養。

小鼠;早期胚胎;培養方法;葡萄糖;序貫培養;單一培養

Abstract:Objective To seek the app rop riate way fo r the culture of mouse early embryos in vitro.Methods One-cell embryos were collected from the oviducts of ICR femalemice,super-ovulated and cultured in glucose-free CZB.The embryos,respectively at two-cell,four-cell or morula stage,were removed from glucose-free CZB medium and p laced in CZB medium supp lemented w ith 3.0 mmol/L glucose(op timal concentration).The embryos in the o ther two group swere cultured in CZB supp lemented w ith 3.0 mmol/L glucose during the entire culture time w ith or w ithout renewal of medium.The embryos in the control group were continuously cultured in glucose-free CZB.Embryo development was reco rded at 24 h,48 h,72 h and 96 h respectively culture.Results (1)Shift embryos from glucose-free CZB to glucose-containing CZB at two-cell o r four-cell stage,the blastocyst rates significantly increased compared w ith the control group.(2)The blastocyst rates of w hich the embryos were continuously cultured in glucose-containing CZB during the entire culture time w ith or w ithout renewal of medium,were significantly higher than that of the control group.(3)Shift embryos from glucose-free CZB to glucose-containing CZB atmorula stage,the blastocyst rates did not increase compared w ith the control group.(4)The blastocyst rates,shift embryos from glucose-free CZB to glucose-containing CZB at two-cell o r four-cell stage and continuously cultured in glucose-containing CZB during the entire culture time w ith o r w ithout renewal of medium,were 46.5%,38.4%,41.7%and 56.6%respectively,but there were no significant differences among groups.Conclusion Exposure of embryos to glucose,beginning at the two-cell and extending to themo rula stage,is necessary for the developmentof ICR mouse embryos in vitro.Sequential Culture is sufficient,but is not necessarily superior to continuous Culture without renewal of medium.

Key words:mouse;early embryo;culturalmethod;glucose;sequential culture;continuous culture

隨著人類輔助生殖技術、轉基因、核移植、胚胎干細胞、基因打靶等生命科學領域高新技術的深入開展,人們要求獲得更多的囊胚率及更高質量的胚胎,如何提高胚胎體外培養的囊胚率及胚胎的發育質量,關鍵之一是改進胚胎體外培養條件使其更接近體內發育環境。目前,改進哺乳動物胚胎體外培養主要采取以下方法:(1)改進培養液成分;(2)與體細胞或體細胞條件液共同培養;(3)序貫培養。其中序貫培養近年來已成為研究的熱點。

序貫培養是指按照體外培養胚胎在不同發育時期代謝需求的不同,配制成一系列不同成分的培養液,進行序列更換,從而延長胚胎在體外的培養時間,增加體外篩查機會,獲得囊胚移植,以期提高妊娠率的方法。胡泊等[1]研究證實,2-細胞期的小鼠胚胎經過序貫培養獲得的8-細胞期胚胎率、桑椹期胚胎率及囊胚率均顯著高于單一培養組,說明序貫培養方法的應用,可以使具有發育潛能的優質胚胎增多,從而使達到囊胚期的胚胎數增加。而Biggers等研究表明,不更換培養基,使用KSOMAA培養基在體外培養5 d,其囊胚的產量與更換培養基無差別,另有前瞻性隨機研究,比較單一復合培養(不包括共培養)和序貫培養對人類IVF囊胚發育的影響,結果表明,在囊胚形成率、植入率及妊娠率方面沒有差別[2]。目前序貫培養是否優于單一培養意見不一。本研究將 ICR小鼠1-細胞胚胎分別放入無糖CZB及含糖CZB中進行單一培養和序貫培養,比較其差異性,以期獲得一條穩定的早期胚胎體外培養途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 ICR小鼠購自昆明醫學院動物科,葡萄糖由美國Sigma公司提供,白色粉末;孕馬血清促性腺激素(p regnant mare serum gonadotropin,PM SG)由寧波第二激素廠生產,每支1 000 u,白色粉末;絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)由瑞士雪蘭諾大藥廠生產,每支5 000 u,白色粉末;配制CZB培養基和CZB-HEPES液的各試劑均購自美國Sigma公司,礦物油購自美國Sigma公司。

1.2 培養液 培養用的CZB培養基參照Chato t配方,CZBHEPES在CZB配方的基礎上加入 HEPES-Na 20 mmol/L,NaHCO3降至5 mmol/L,BSA用 PVA代替,上述培養液用0.22μm孔徑的微孔膜過濾后放置4℃冰箱儲存備用。CZB培養基與一定比例葡萄糖混合,配制成含3.0 mmol/L葡萄糖的CZB培養液。

1.3 動物的超排 選取6～8周的 ICR雌鼠和8～10周的ICR雄鼠,實驗前雌鼠先腹部注射10 u PMSG,間隔46～48 h腹部注射10 u HCG,隨后與雄鼠按1∶1比例合籠交配,次晨檢查陰栓,有陰栓者提示已交配。

1.4 胚胎的收集 在注射 HCG后22～26 h,將有陰栓的雌鼠用頸椎脫臼法處死,取1-細胞胚胎定為第1天,75%乙醇消毒腹部后,打開腹腔,分離輸卵管并除去黏附的血液和脂肪,剪下輸卵管迅速將其置于預溫的hepes液中,于解剖鏡下用連有1 m L注射器的5號針頭將輸卵管壺腹部明顯膨大處穿破,使胚胎流出,如果受精卵還被顆粒細胞包裹,用移液槍將胚胎移入透明質酸酶300 u/mL中,消化去除顆粒細胞,經 CZBHEPES洗滌2次,在Nikon40倒置顯微鏡下觀察胚胎形態,挑選有第二極體或雙原核的形態正常的受精卵用于體外培養。

1.5 胚胎培養 本實驗采用微滴法培養,每滴中按10個胚胎/20μL培養液的密度放置鼠胚。培養皿于培養前1 d準備,并放入37℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養箱中平衡一夜,從每只雌鼠中獲得的胚胎均被平均分配到各組中,這樣每個培養滴中含有多個雌鼠的胚胎。胚胎在37℃、5%CO2和飽和濕度的CO2培養箱中持續培養96 h。

1.6 實驗設計 在前期的工作中,作者前期對CZB培養基中碳水化合物(葡萄糖)作了一定的研究,發現葡萄糖對 ICR小鼠胚胎體外發育起重要作用,在CZB培養基中,小鼠胚胎體外培養的最適葡萄糖濃度為3.0 mmol/L,故選擇葡萄糖的濃度為3.0 mmol/L[3]。將從 ICR小鼠體內取出的1-細胞胚胎按隨機分組的原則分別放入以下各培養液中進行體外培養。實驗共分6組:1組(對照組),胚胎培養全程均在不含葡萄糖的CZB培養液中。2組,1-細胞至2-細胞階段在無糖CZB培養基中,2-細胞至囊胚階段移入含3.0 mmol/L葡萄糖的CZB中培養;3組,1-細胞至4-細胞階段在無糖CZB培養基中,4-細胞至囊胚階段移入含3.0 mmol/L葡萄糖的CZB中培養;4組,1-細胞至桑椹胚階段在無糖CZB培養基中,桑椹胚至囊胚階段移入含3.0 mmol/L葡萄糖的CZB中培養;5組,地胚胎培養全程在含3.0 mmol/L葡萄糖的CZB培養液中,1～5組在體外均更換一次培養液,更換培養液時移動一次胚胎,移動胚胎時勿將胚胎遺失;6組,胚胎培養全程均在含3.0 mmol/L葡萄糖的CZB培養液中,培養全程不更換培養液,無胚胎移動。2～6組為實驗組,具體操作見圖1。每組胚胎均在體外培養96 h,觀察2-細胞率、4-細胞率、桑椹胚率、囊胚率。

1.7 統計學方法 采用SPSS11.5統計學軟件包,對各階段發育率的比較采用卡方檢驗。

圖1 不同培養階段更換培養液培養小鼠早期胚胎的示意圖

2 結 果

表1 不同培養方法對1-細胞小鼠胚胎體外發育的影響

不同的培養方法對1-細胞小鼠胚胎體外發育的影響。2-細胞、4細胞階段從無糖CZB更換到含糖CZB中的序貫培養,囊胚率高于對照組,差異有統計學意義(P＜0.05);培養全程均在含糖CZB中,其中更換一次培養液的單一培養囊胚率高于對照組,差異有統計學意義(P＜0.05);培養全程均在含糖CZB中,不更換培養液的單一培養囊胚率高于對照組,差異有統計學意義(P＜0.05);桑椹胚階段從無糖CZB中更換到含糖CZB中的序貫培養,囊胚率與對照組差異無統計學意義(P＞0.05)。各實驗組2-細胞率、3-8細胞率、桑椹胚率與對照組及各實驗組間差異均無統計學意義(P＞0.05)。2-細胞、4-細胞更換培養液的序貫培養與培養全程在含糖CZB中的單一培養囊胚率差異無統計學意義(P＞0.05);培養全程均在含糖CZB中移動一次胚胎的單一培養與培養全程均在含糖CZB中不移動胚胎的單一培養囊胚率差異無統計學意義(P＞0.05)。具體結果見表1。

3 討 論

3.1 不同階段葡萄糖對胚胎發育的影響 更新培養基的原因之一是在培養的某一階段除去某些有害物質,比如氨;另一個原因是考慮到胚胎植入前生理和代謝方面的重要變化。第二考慮依賴于兩個假說。第一個假說認為,當植入前胚胎從輸卵管向子宮移動的過程中其內環境發生了變化。這個假說現存的證據是 Gardner[4]和Lane[5]關于非妊娠婦女輸卵管液及子宮液中葡萄糖和丙酮酸的分析資料。該研究資料顯示,在人類輸卵管液中,葡萄糖濃度隨著月經周期的循環而變化,卵泡階段是3.11 mmol/L,月經中期降到0.50 mmol/L,黃體期升至2.32 mmol/L;子宮液中葡萄糖的濃度恒定為3.15 mmol/L。輸卵管液中丙酮酸的濃度恒定于0.24 mmol/L,子宮液中丙酮酸的濃度恒定于0.1 mmol/L。第二個假說認為,隨著胚胎的代謝,胚胎所處環境中的化學成分發生了變化。這個假說的理論基礎是,在動物模型和人類胚胎的早期發育中,丙酮酸的利用超過葡萄糖,而到桑椹胚階段,恰恰相反,葡萄糖的利用超過丙酮酸。優先利用葡萄糖或丙酮酸似乎由于輸卵管液與子宮液中葡萄糖和丙酮酸濃度上的差異造成。但這種解釋缺乏嚴密性,因為它忽略了一點,只要環境中所給化學成分的濃度在允許的范圍內,胚胎可能從中選擇性地利用其所需要的化學成分。

本實驗將ICR小鼠1-細胞胚胎單一培養于無糖CZB與含糖CZB中,同時序貫培養于無糖CZB及含糖CZB中,分別觀察各自的發育情況。研究結果顯示:2-細胞、4-細胞更換入含糖CZB中的序貫培養囊胚率顯著高于無糖CZB組,而與單一培養于含糖CZB組中差異無統計學意義。桑椹胚階段更換入含糖CZB中的序貫培養囊胚率明顯低于在含糖CZB組中的單一培養,而與無糖CZB組差異無統計學意義。該結果提示,除了丙酮酸、乳酸作為胚胎發育的重要能量底物之外,葡萄糖也是重要的能量物質或者對胚胎早期發育存在重要支持,它對胚胎的卵裂和囊胚的形成有很大影響。葡萄糖究竟于何階段起作用及其作用如何?本實驗顯示,2-細胞、4-細胞以后補充葡萄糖,囊胚率顯著提高,僅僅于桑椹胚及以后階段添加葡萄糖無法逆轉胚胎發育,囊胚形成率很低,提示小鼠胚胎體外發育在2-細胞以后桑椹胚前對葡萄糖存在依賴性,此時培養液中補充葡萄糖是必要的。2-細胞以后添加葡萄糖囊胚率增加,可能由于胚胎早期卵裂主要依靠丙酮酸和乳酸供能,2-細胞以后隨著卵裂速度加快,胚胎逐步動用葡萄糖,此時胚胎基因組由母源性調控轉移到合子型調控,葡萄糖能量代謝途徑開放,故2-細胞以后添加葡萄糖是必要的。然而,胚胎致密化后即桑椹胚階段再補充葡萄糖為時已晚,囊胚率仍很低。可能的原因有:(1)在無糖的情況下,胚胎主要利用丙酮酸及乳酸代謝供能,但這種能量供給是有限的,若無其他能量物質替代只能支持胚胎發育到桑椹胚,不能支持胚胎后期的發育;(2)桑椹胚階段加糖仍不能補救,可能由于桑椹胚期葡萄糖代謝途徑受限,也可能由于囊胚的形成必須通過提前代謝葡萄糖儲備某些物質,其具體的機制有待進一步研究。

3.2 序貫培養與單一培養對小鼠早期胚胎體外發育的影響早期人們對于序貫培養認識尚不深刻,自從用于成功培養人類合子至囊胚階段的連續培養液 G1、G2出現[5](G1培養液是為了支持到8-細胞階段的發育,G2培養液是為了支持8-細胞階段到囊胚的發育),序貫培養受到研究者的密切關注。由于序貫培養有利有弊,利在胚胎發育的不同時期對不同物質的需求,弊在胚胎體外培養過程中反復的體外操作可能對胚胎發育造成影響。因此,不少研究者力求在單一培養上有所突破。

為進一步研究比較序貫培養與單一培養的差異,本研究結果顯示,一步法全程含糖培養的囊胚率最高,序貫培養囊胚率均有所下降,表明在本研究范圍內,序貫培養似乎不能改善胚胎最終的發育結局。該結論并不支持胡泊等的研究,造成上述差異的原因可能與小鼠的品系、培養液的成分、樣本量的大小、胚胎培養時期、試劑來源等不同相關。Swain等[6]研究證實,葡萄糖對哺乳動物胚胎早期發育沒有抑制作用,故一開始就加入葡萄糖的單一培養并不影響胚胎的發育。本實驗也驗證了這一結論,2-細胞、4-細胞階段開始添加葡萄糖的序貫培養并不能提高小鼠胚胎體外培養的囊胚率。

另一方面,一步單一培養及兩步單一培養的囊胚率分別為56.6%、41.7%,其囊胚獲得率偏低(一般應大于80%),可能與自配的培養液有關。雖然兩組差異無統計學意義,但相關的數據表明,兩步單一培養囊胚率有所下降,說明移動胚胎對胚胎體外發育還是造成一定影響,尚且移動胚胎后胚胎質量有否受損目前尚不明確。由于序貫培養同樣需要進行移動胚胎的操作,移動胚胎既增加了體外的操作又可能對胚胎發育造成影響,因此,序貫培養雖然是有效的,但并不一定優于一步單一培養。

[1] 胡泊,孫云霞,史敏,等.序貫培養對小白鼠胚胎體外發育的影響[J].新疆醫科大學學報,2003,26(4):368.

[2]Macklon NS,Pieters M H,Hassan MA,et al.A p rospective randomized comparison of nsequential versus monoculture system s fo r in-vitro human blastocyst development[J].Hum Rep rod,2002,17:2700.

[3] 丁芳,周紅林,劉洋,等.葡萄糖對 ICR小鼠胚胎體外發育的影響[J].動物學研究,2007,28(5):501.

[4] Gardner DK,Lane M,Calderon I,et al.Environment of the p reimplantation human embryo in vivo:metabolite analysis of oviduct and uterine fluids and metabolism of cumulus cells[J].Fertil Steril,1996,65:349.

[5] Gardner DK,Lane M.Culture and selection of viable human blastocysts:a feasible p roposition fo r human IVF.Hum[J].Rep rod Update,1997,3:367.

[6] Swain JE,Bormann CL,Clark SG,et al.Use of energy substrates by various stage p reimp lantation pig embryo p roduced in vivo and in vitro[J].Rep roduction,2002,123:253.

Study on culturalmethod of mouse early embryos in vitro

D ING Fang1,L I Zhi-ying1,ZHOU Hong-lin2△,et al.
(1.Department of Gynecology and Obstetrics,Renhe Hospital of Three Gorges University,Yichang,Hubei 443001,China;2.Department of Gynecology,2nd A ffiliated Hospital of Kunm ing M edical College,Kunm ing,Yunnan 650101,China;3.Kunm ing Institute of Zoology,the Chinese Academ y of Sciences,Kunm ing,Yunnan 650223,China)

R321.4;R-332

A

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2009-08-05

2009-09-28)