魚油對外周動脈疾病的治療作用和機制研究

石 駿

(四川省南溪縣人民醫院 644100)

本研究證明CD44和CD44v3在炎癥性疾病PAD患者外周血單核細胞上有較高的表達,并且該高表達可以被魚油下調。

1 臨床資料

1.1 研究人群 研究方案包括了PAD患者和健康受試者,該研究獲得了倫理委員會的同意,并給每位受試者簽署了知情同意書。納入患有癥狀性PAD(穩定的間歇性跛行)、踝臂壓力指數小于0.9的男性患者和健康男性對照。排除了嚴重下肢缺血或在3個月前曾接受任何形式治療的患者;排除患有任何部位動脈疾病或踝臂壓力指數小于0.9的健康對照。健康對照均不能患有糖尿病、慢性炎癥疾病,或正在接受免疫抑制治療;被排除者還包括未受到良好控制的高血壓患者(收縮壓大于160 mm Hg,舒張壓大于90mm H g),或在過去的5年內曾患有惡性疾病的患者,未服用魚油膠囊或每周吃1條以上的魚的患者。受試者在采血前2周內無感冒或輕度感染。

1.2 實驗設計 試驗開始時,所有患者和受試者在饑餓狀態下采血以檢測各項指標的基線水平,血樣收集在 CPDA或EDTA抗凝的樣品管中,并讓血樣在室溫下凝集1 h。所有的受試者每天服用6×1 g的魚油膠囊共12周,這樣能夠保證每天攝入1.02 g二十五碳五烯酸和0.69 g的二十二碳六烯酸。12周后第2次采集饑餓狀態下的血樣。

1.2.1 血漿三酰甘油和膽固醇的測量 采用標準色度法,檢測血漿三酰甘油、總高密度脂蛋白膽固醇和總低密度脂蛋白膽固醇的濃度。

1.2.2 血液單核細胞分離 從CPDA保存的血樣中分離單核細胞。采用6%的葡聚糖沉淀法除去紅細胞,得到的富含白細胞的血漿在Nycoprep1.068上進行分層,并在室溫下采用650 r/m in離心15m in,除去上層成分,含單核細胞的成分轉移入新鮮的試管,然后用含0.3%的小牛血清清蛋白的PBS的洗滌。在6 m L的PBS-A中重新懸浮細胞,300 r/m in離心7m in以除去血小板。

1.2.3 流失細胞儀 對CPDA保存的全血樣進行流式細胞分析。采用Serotec公司生產的結合藻紅蛋白(PE)的抗CD14抗體和結合異硫氰酸熒光素(FITC)的抗CD54或抗CD44抗體進行標記。采用抗鼠的IgG1-FITC抗體和抗鼠的IgG2a-PE抗體作為同種型的對照抗體以明確背景色情況。黑暗狀態下在飽和濃度的抗體培養液內培養細胞30 min,用PBS-A洗滌,在BD FACSCalibur流式細胞儀上采用Ce llquest軟件進行分析。表達CD14的細胞被認為是單核細胞。采集單核細胞表面的CD44或CD54的中位熒光強度。

1.2.4 CD44v3測定 在平底96孔組織培養皿上培養單核細胞,培養基包括:0.75 mmoL的 L-谷氨酸、0.1 mg/m L的鏈霉素、0.1mg/m L的青霉素和5%的自體血清。每孔加入100 uL的培養基和3×104個細胞。部分培養的細胞接受10mg/m L的細菌內毒素的刺激。20 h后,采用500 g(重力常數)的離心力對培養皿進行離心,并將培養基換成冰塊冷卻的100 u L 2%甲醛,在4℃下固定細胞15m in。棄去甲醛,風干細胞,將培養皿用石蠟封口,-20℃儲存備用。

解凍培養皿后,用含0.15%的 Tw een20(Sigma公司)的PBS液沖洗。1%的清蛋白阻斷非特異性結合后,培養孔用PBS-Tw een液洗滌,再和 100μL 1μg/m L的鼠抗人CD44v3克隆或對照抗體共同孵育。用2%山羊血清阻斷非特異性結合,100μL 0.5μg/m L的辣根過氧化物酶結合的羊抗鼠多克隆抗體STAR77(Sigma公司)共同孵育。再用PBS-Tw een洗滌培養皿,鄰苯二胺(Dako Cytomation)著色,100μL 1 mol/L的硫酸阻斷反應。將培養皿在490 nm下,用Titretek+MS2平皿閱讀器閱讀。記錄 2次光密度值(OD)的平均值,以CD44v3孔減去兩個對照孔的平均值作為最后結果。

2 結 果

2.1 PAD患者和健康受試者的一般情況比較 48例PAD患者(年齡45～84歲)和 54例健康對照(年齡 46～84歲)被納入研究。兩組受試者的一般情況比較見表1。高密度脂蛋白膽固醇比率和血漿三酰甘油濃度這一指標兩組之間差異無統計學意義,C反應蛋白的濃度PAD組高于對照組。

表1 PAD患者和健康對照組的一般情況比較

表1(續) PAD患者和健康對照組的一般情況比較

2.2 魚油在調節PAD患者單核細胞CD44表達中的作用來源于PAD患者的單核細胞CD44的表達高于對照組,中位熒光強度分別為(480±27.8)OD和(336±25.1)OD(P＜0.05)。給予膳食補充魚油12周后,PAD患者血單核細胞CD44的表達有所下降,中位熒光強度給藥前為(480±27.8)OD,給藥后為(427±26.2)OD(P＜0.05),但對照組患者的變化不明顯,中位熒光強度給藥前為(336±25.1)OD,給藥后為(355±28.0)OD,圖 1。

圖1 兩組外周血單核細胞的CD44表達在服用魚油前后的變化(P＜0.05)

2.3 培養單核細胞CD44v3的表達 PAD患者來源的單核細胞CD44v3的表達低于健康對照者來源的單核細胞,PAD患者(0.15±0.15)OD,對照組(0.22±0.14)OD,P＜0.05。補充魚油能夠增加PAD患者來源的單核細胞的CD44v3的表達,給藥前(0.15±0.15)OD,給藥后(0.27±0.23)OD,P＜0.05。但是不能增加對照組來源的單核細胞CD44v3的表達,給藥前(0.22±0.14)OD,給藥后(0.17±0.1)OD,P＜0.05。

3 討 論

本研究顯示,PAD患者外周血單核細胞CD44表達量高于健康對照組。K rettek等[1]的Western blot檢驗結果表明血管粥樣斑塊中CD44的含量高于對照組,與本研究結果相似。本研究發現動脈粥樣硬化患者外周血單核細胞CD44表達量較健康對照組高,且飲食中添加魚油可降低動脈粥樣硬化患者外周血單核細胞CD44的表達量,而對健康對照組無影響。

CD44與HA的結合對 HA的分解代謝起重要作用,而HA分解后產生的20 kDa亞單位可激活炎性細胞因子和基質金屬蛋白酶,以及促進內皮細胞損傷[2]。魚油飲食可降低某些炎性反應標志物的水平[3]。因此,魚油飲食降低炎性反應的作用機制,很可能是降低外周血單核細胞CD 44表達量,從而降低HA的分解代謝。

根據魚油飲食可降低血管疾病患者外周血單核細胞CD44表達量的研究結果,作者提出假設——魚油飲食通過降低外周血單核細胞CD44的表達量,從而降低H A的分解代謝,減少HA分解所產生的炎癥誘發因子,最終減弱泌物阻塞,在中葉開口周圍分布有三組淋巴結,當受到炎癥刺激后,局部的淋巴結變得腫大,壓迫支氣管從而導致管腔狹窄[3]。但據本組病例中在纖維支氣管鏡下所見,在右中葉管口除了有炎癥改變之外,大部分未見管口狹窄引流不暢改變,絕大多數管腔是完整的。因此我們認為,右中葉肺不張發生率相對較高,右中葉不張可能與肺泡表面活性物質相對減少有關[4]。

3.3 纖維支氣管鏡檢查及治療 病因的檢出率:本組76例老年肺不張患者,病因經纖維支氣管鏡檢出率達92.1%。病因中肺癌占據首位,占總數的64.5%,故應積極進行檢查,以便及早進行相關治療。

纖維支氣管鏡檢查及治療:通過纖維支氣管鏡可直接窺見患者肺不張支氣管內的形態變化。從鏡檢與病理結果的對比中可以發現,癌癥肺不張通常病變多表現為結節、菜花樣及息肉樣,向管壁阻塞、浸潤,多見于未分化癌[6];表面有壞死組織及水腫偽膜,活檢質脆,容易出血者一般為鱗癌。支氣管內膜結核表現為黏膜肥厚狹窄、糜爛潰瘍、充血水腫、瘢痕狹窄,與鄰近支氣管黏膜無明顯界限,有較廣泛的浸潤病變,有時呈多形性、多發性肉芽腫,腫塊質軟韌。炎癥所致肺不張大部分為水腫、黏膜充血、膿性分泌物形成膿栓或堵塞。

通過纖維支氣管鏡可以對患者病變部位活檢、刷檢,可以明確病因。本組76例患者的診斷率為92.1%。通過纖維支氣管鏡檢查不但可以對惡性病變得出明確的診斷結果,進而指導以后的治療,對于良性病變,更可以通過纖維支氣管鏡吸凈血塊、分泌物等異物,促進患者的肺部復張。對于吸引出的分泌物進行細菌學培養,使得結果更為可靠,從而可以指導對患者進行相關的抗感染用藥治療。纖維支氣管鏡檢查操作方便,只要術中注意監護,操作熟練輕巧,很少出現嚴重的并發癥,本組中無1例出現氣胸、喉痙攣、心搏呼吸驟停等嚴重并發癥。因此,老年人肺不張經纖維支氣管鏡檢查是一項有效、安全、必不可少的診斷手段。

綜上所述,運用纖維支氣管鏡檢查老年肺不張,是明確病因的一種非常重要的方法。應及早進行,及早確診,為患者的治療掌握先機。

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