人腎上腺皮質腺癌細胞株裸鼠移植瘤模型的建立及其意義*

蔣 莉,羅佐杰△,鄺曉聰,梁杏歡,秦映芬,盧德成

(廣西醫科大學:1.第一附屬醫院內分泌科;2.病理生理學教研室;3.第一附屬醫院老年內分泌科,南寧 530000)

腎上腺皮質腺癌(ad renocortical carcinoma,ACC)是發病率較低的癌癥之一,發病率不到百萬分之一[1]。因此,病例數量少,標本獲取困難,成為ACC研究的難題。在研究癌癥的各種實驗中,動物模型成為有效的實驗工具。目前,國內外已有眾多學者建立了大量癌癥的動物模型,但對于ACC來說,動物模型的建立比較少見。本實驗采用注射人腎上腺皮質腺癌細胞株(SW-13)至裸鼠腋窩皮下的方法建立人ACC動物模型,

旨在為ACC的研究提供有效的實驗工具。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性 BALB/c裸鼠5只,鼠齡4～6周,體質量18～20 g,購于上海斯萊克公司。在無特異性病原體(SPF)、恒溫(22～26℃)、恒濕(50%～60%)的空氣潔凈的飼養架內飼養。籠具、墊料、飼料均經高壓蒸汽滅菌,飲水為高壓滅菌的純凈水。

1.2 細胞株 SW-13購于中科院上海細胞庫,在 5%CO2、37℃培養箱中常規進行細胞培養,培養方式為置于含10%胎牛血清的F12/DMEM培養液中,以0.25%胰蛋白酶和0.53 mmol/L EDTA混合液消化傳代。

1.3 方法

1.3.1 ACC皮下模型的建立 參照王亞林等[2]的建立方法,

取對數生長期SW-13細胞,用D-H anks液去除培養瓶中殘余培養基,以0.25%胰蛋白酶消化,鏡下觀察當細胞變圓、細胞與培養瓶底脫落時,用含10%胎牛血清的F12/DM EM培養基終止消化。800 r/min離心5 min,棄上清液,用含10%胎牛血清的F12/DM EM 培養基重懸,調整密度至 1×107/m L,用0.5 m L注射器注射至裸鼠兩側腋窩皮下,每側注射量為0.2 m L。

1.3.2 成瘤觀察及取材 接種SW-13細胞后,每天觀察裸鼠進食和精神狀態。觀察腫瘤形成、生長情況并記錄腫瘤直徑大小。9周后,將裸鼠用乙醚麻醉后處死,將腫瘤取材,以電子天平稱重并取部分腫瘤組織,置10%甲醛固定液中固定,石蠟包埋,做常規病理切片,行 HE染色。然后分別將心、肝、脾、肺、腎及股骨取材,置10%甲醛固定液體中固定。

2 結 果

2.1 成瘤率及腫瘤生長情況 6周后5只裸鼠均在腋窩皮下肉眼可見腫瘤,成瘤率為100%。腫瘤直徑隨時間推移逐漸增大。第8～9周,瘤塊直徑可達2～3 cm,腫瘤質硬,活動度較差(圖1)。

2.2 腫瘤及各臟器肉眼所見 肉眼見腫瘤位于皮下,表面凹凸不平,呈結節狀,實質性。腫瘤表面有出血灶。腫瘤邊界清楚,與周圍組織易剝離,但底部與腋窩軟組織聯系較緊密,較難剝離。外觀呈粉紅色,剖面成魚肉狀,中間部分大量壞死,呈灰白色(圖2)。各臟器肉眼觀察均未發現轉移灶。

2.3 病理學檢查 HE染色后光鏡下(×400)觀察,腫瘤由大量癌細胞組成,癌細胞排列緊密,不規則,間質少。癌細胞呈大小不均的圓形,異形性明顯,核呈圓形、橢圓形,大小不等,核分裂相多見。可見病理核分裂相,染色質較粗,深染,核仁多見(圖3)。

圖1 裸鼠雙側腋窩皮下SW-13移植瘤(箭頭所示)

圖2 皮下移植瘤肉眼所見

圖3 皮下移植瘤HE染色結果(×400)

3 討 論

難以獲取臨床標本給ACC的研究帶來了一定的困難,但是借助動物模型可以有效解決部分難題。對于理想的ACC動物模型,是能夠在宿主體內模擬人ACC的發生、發展等各種生物學特性,并且重復性好,具備標準化。因此,原位移植成為備受推崇的動物模型建立方法[3]。但是ACC很難實現的原因:(1)腎上腺是重要的內分泌器官,微小的影響即可對整個機體造成嚴重的影響;(2)裸鼠的腎上腺體積過小,模型建立很難實現。這兩者決定了將癌細胞注射至腎上腺構建移植瘤動物模型的方法不可行。因此,只有采用其他的方法,使構建的動物模型盡可能接近理想模型。與其他的移植瘤模型相比,皮下移植瘤模型接種更為方便,容易在實驗過程中觀察腫瘤生長情況[4]。因此,選擇皮下移植不失為一種可行的辦法。

本實驗采用 SW-13細胞株,此細胞系由Leibovitz等[5]建立,是一株非常穩定的細胞系。將此細胞系注射于裸鼠雙側腋窩皮下后,腫瘤形成時間較一致,經過6周左右的潛伏期成瘤,成瘤率達100%,提示SW-13細胞侵襲能力相當高。因此,此方法可以為ACC的研究提供有效的實驗工具[6-7]。然而,在臨床上 ACC常見的轉移部位是腹膜、肺、肝、骨,但是,本次建模后均未在各臟器發現轉移灶,提示裸鼠皮下注射的方法較難建立轉移模型,而在國內外文獻中均未見到建立ACC轉移模型的相關報道。ACC轉移模型的建立仍然是一個難題,尚需進一步研究。

[1]Kebebew E,Reiff E,Duh QY,et al.Ex tent o f disease at presentation and outcome for adrenocortical carcinoma:have w emade p rogress?[J].World JSurg,2006,30(5):872.

[2]王亞林,靳風爍,李彥鋒,等.Apoptin對人膀胱癌裸鼠皮下移植瘤的抑瘤作用研究[J].重慶醫學,2008,37(9):940.

[3]周琪,梁后杰,閻曉初,等.人結腸癌裸鼠原位移植瘤模型的建立[J].重慶醫學,2007,36(19):1929.

[4]盛書娟,花亞偉,張占東,等.人胃腸間質瘤裸鼠移植瘤模型的建立[J].醫藥論壇雜志,2009,30(10):16.

[5]Leibovitz A,M c Combs WM,Johnston D,et al.New human cancer cell culture lines SW-13,small-cell carcinoma of the adrena l cortex[J].JNatl Cancer Inst,1973,51(2):691.

[6]T ritos NA,Cushing GW,Heatley G,et al.Clinical features and p rognostic factors associated w ith ad renocortical carcinoma:Lahey clinicmedical center experience[J].Am Surg,2000,66(1):73.

[7]Xiao XR,Ye LY,Shi LX,et al.Diagnosis and treatmentof adrenal tumours:a review of 35 years′experience[J].Br J U rol,1998,82(2):199.