UPLC-PDA法同時測定燈盞細辛中飛蓬苷、綠原酸和野黃芩苷的含量

鄭 林， 王永林， 王愛民， 喬 希， 官志忠， 蘭燕宇*

(1.貴陽醫學院藥學院，貴州貴陽550004;2.貴陽醫學院分子生物學重點實驗室，貴州貴陽550004)

燈盞細辛又名燈盞花，為菊科植物短葶飛蓬［Erigeron breviscapus(Vant.)hand-Mazz.］的干燥全草，主產于云南、貴州、廣西、四川等地，具有祛風散寒，活血通絡止痛等功效;國內市場上已開發出該藥的凍干粉針、注射液、膠囊劑、片劑、滴丸等單味藥制劑，主要用于治療心腦血管疾病、眼科疾病及老年性疾病，具有廣闊的開發應用前景［1］。燈盞細辛中的化學成分主要含有黃酮類、咖啡酸酯類、酚酸類化合物以及其它類化合物。目前燈盞細辛及制劑中多采用高效液相色譜法(HPLC)對野黃芩苷單一成分進行含量測定［2，3］，不能全面反映其質量。本研究采用超高效液相色譜(UPLC)法，建立了同時快速、高靈敏測定燈盞細辛中飛蓬苷、綠原酸和野黃芩苷含量的新方法，查閱國內文獻，未見有關定量分析的報道。并對不同產地燈盞細辛藥材此3種成分進行了測定研究，為進一步完善燈盞細辛的質量控制體系提供了實驗依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

液相色譜儀為美國Waters公司Acquity UPLC系統，包括二元高壓梯度泵、自動進樣器、二極管陣列檢測器以及Empower色譜工作站。

1.2 試劑

乙腈、甲醇為色譜純;水為超純水;其他試劑均為分析純。

1.3 對照品、藥材

綠原酸(批號110753-200212)、野黃芩苷(批號110842-200403，純度為97.12%)對照品購自中國藥品生物制品檢定所;飛蓬苷對照品自制(系從燈盞細辛藥材中提取分離，經UV、IR、NMR和MS鑒定結構，HPLC歸一化檢查，純度大于98%以上)。

燈盞細辛樣品來源于云南、貴州和四川等地，并經貴陽醫學院藥學院龍慶德副教授鑒定。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 供試品溶液 精密稱定粉碎過40目篩的燈盞細辛樣品約0.5 g，精密加入50% 甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，離心，取上清液用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，作為供試品溶液。

2.1.2 對照品溶液 精密稱取對照品飛蓬苷14.16 mg、綠原酸6.25 mg、野黃芩苷12.91 mg，置于25 mL量瓶中，用50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成飛蓬苷、綠原酸和野黃芩苷濃度分別為0.566 4，0.250 0，0.501 5 mg/mL混合對照品貯備液。

2.2 色譜條件

色譜柱:Acquity BEH C18(2.1 mm ×150 mm，1.7 μm);流動相:乙腈(A)-0.1% 磷酸(B)，梯度洗脫(0 min，2%A;3 min，5%A;4 min，13%A;6 min，15%A;7 min，18%A;9 min，19%A;9.1 min，80%A;10 min，80%A);流速:0.35 mL/min;柱溫40℃;檢測波長:260 nm(檢測飛蓬苷)，326 nm(檢測綠原酸)和335 nm(檢測野黃芩苷);進樣量:1 μL。在此條件下，飛蓬苷、綠原酸和野黃芩苷與其他組分分離完全，理論塔板數均不低于10 000。對照品及樣品色譜圖見圖1。

2.3 線性關系考察

分別精密吸取上述混合對照品貯備液 0.5，1，2，4，6，8 mL置于10 mL量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，分別進樣1 μL，按上述色譜條件測定，以色譜峰峰面積(Y)為縱坐標，以飛蓬苷、綠原酸和野黃芩苷的濃度(X)為橫坐標，繪制標準曲線并進行線性回歸。飛蓬苷回歸方程為Y=4 934 909X－7 794，r=0.999 9;綠原酸回歸方程為Y=7 287 380X－11 541，r=0.999 6;野黃芩苷回歸方程為Y=4 944 101X+1 346，r=0.999 8;結果表明飛蓬苷、綠原酸和野黃芩苷濃度分別在28.32～453.12，12.50～200，25.08 ～401.20 μg/mL 范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.4 精密度試驗

取上述飛蓬苷、綠原酸和野黃芩苷混合對照品溶液(濃度分別為 113.28，500.00，100.30 μg/mL)重復進樣 6 次，測定峰面積。飛蓬苷、綠原酸和野黃芩苷峰面積的RSD(n=6)為0.76%，0.46%，0.82%。結果表明，儀器精密度良好。

2.5 重復性試驗

精密稱取同一批燈盞細辛樣品(貴州雷山樣品)，共6份，按“2.2.1項供試品溶液”項下方法操作，在上述色譜條件下進樣，飛蓬苷、綠原酸和野黃芩苷的平均含量(n=6)分別為1.60%，0.82%，2.42%;RSD(n=6)分別為1.26%，1.52%，1.16%。結果表明，重復性良好。

圖1 對照品(A)與貴州雷山樣品(B)UPLC色譜圖

2.6 穩定性試驗

取同一供試品溶液(貴州雷山樣品)，分別在 0，1，2，4，8，12 h進樣分析，測得飛蓬苷、綠原酸和野黃芩苷峰面積的RSD(n=6)分別為0.69%，1.33%，1.56%。結果表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.7 回收率試驗

精密稱取6份已知含量的燈盞細辛(貴州雷山樣品)約0.25 g，分別按相當于藥材中飛蓬苷、綠原酸和野黃芩苷100%的量精密加入混合對照品溶液，按供試品溶液的制備方法制得供試品溶液，進樣測定，求得飛蓬苷、綠原酸和野黃芩苷回收率平均值(n=6)分別為101.43%，97.49%，99.38%;RSD分別為1.72%，1.61%，2.04%。

2.8 樣品測定

取收集的不同產地的燈盞細辛藥材，按“2.1.1供試品溶液”項下方法操作，在上述色譜條件下進行分析，用外標法計算樣品中飛蓬苷、綠原酸和野黃芩苷的含量。14批藥材含量測定結果見表1。

表1 不同產地燈盞細辛樣品中飛蓬苷、綠原酸和野黃芩苷的含量測定結果(n=2)

3 討論

3.1 檢測指標的選擇

近年來隨著燈盞細辛研究的深入，發現除了以野黃芩苷為代表的黃酮類成分外，其所含的酚酸類成分和其它小分子化合物也是燈盞細辛中不可忽視的活性成分［4］。筆者從燈盞細辛中分離鑒定出了飛蓬苷、綠原酸等化合物，且在藥材中含量較高。本文同時測定了燈盞細辛中飛蓬苷、綠原酸和野黃芩苷的含量，為更客觀地評價燈盞細辛的質量提供了實驗依據。

3.2 提取方法的選擇

中國藥典2005年版一部［5］與《貴州省中藥材民族藥材質量標準》(2003年版)［6］燈盞細辛含量測定項下的方法在提取方法、提取溶劑上有較大差異。為此，對兩種測定方法進行了試驗比較，結果表明藥典方法測定結果明顯偏低，分析其原因，主要是藥典法采用三氯甲烷索式提取后甲醇索提的方法對野黃芩苷提取不完全所致。因此，我們在《貴州省中藥材，民族藥材質量標準》燈盞細辛回流提取方法的基礎上，對提取溶劑、提取時間進行了考察，以50%甲醇回流提取2 h綜合指標較好，具有操作簡便、快速靈敏等優點。

3.3 檢測條件的選擇

本研究采用UPLC方法，在10 min內即可同時準確測定燈盞細辛中飛蓬苷、綠原酸和野黃芩苷的含量;UPLC作為HP LC分析方法的一種突破，為中藥多成分復雜體系的分析提供了一種新的強有力工具。試驗曾對不同配比流動相系統進行考察，結果表明，以乙腈-0.1%磷酸為流動相梯度洗脫分離效果較好。利用二極管陣列檢測器(PDA)檢測，得到各波段的三維色譜及光譜圖，其色譜峰與相應對照品色譜峰的保留時間及紫外光譜一致;飛蓬苷、綠原酸和野黃芩苷分別在260，326，335 nm有最大吸收，飛蓬苷在300 nm后基本無吸收，綠原酸和野黃芩苷在260 nm附近為吸收波谷，在同一波長下的測定結果不甚理想，因此，采用PDA選擇在各成分最大吸收波長下進行測定，提高了檢測靈敏度。經過方法學考察，證明本方法準確可靠，重復性好。

3.4 測定結果分析

經對不同產地的燈盞細辛中飛蓬苷、綠原酸和野黃芩苷含量測定，表明本方法能達到有效分離各組分的目的，可作為燈盞細辛的質量控制方法;同時表明不同地域的燈盞細辛中3種成分的含量存在明顯差異，說明生態環境、采收時間和儲存條件等可能對含量產生影響。上述結果提示，為保證燈盞細辛相關制劑批次間質量的一致性，應加強燈盞細辛的質量控制，必要時固定藥材的來源。

［1］楊 莉.燈盞花制劑的臨床應用［J］.四川中醫，2007，25(3):40-42.

［2］王淑紅，熊 英，王祥紅.加速溶劑萃取法用于燈盞細辛中燈盞乙素的測定［J］.藥物分析雜志，2006，26(5):703-705.

［3］戴 航，侯小濤，謝植轟，等.益脈康膠囊質量標準研究［J］.中成藥，2008，30(6):11-13.

［4］孫漢董.現代化是中藥與植物藥發展的必由之路［J］.云南中醫學院學報，2004，27(1):3-5.

［5］中國藥典［S］.一部.2005:100.

［6］貴州省藥品監督管理局編.貴州省中藥材民族藥材質量標準.2003年版［S］.貴陽:貴州科技出版社，2003:172.