HPLC-PDA測定銀屑靈流膏中5種成分含量

陳有軍， 趙瑞芝， 趙 瑩， 盧傳堅

(廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣東廣州510006)

銀屑靈為廣東省中醫院的醫院制劑，處方來源于廣州中醫藥大學名老中醫禤國維教授。由當歸、赤芍、川芎、金粟蘭、土茯苓、烏梅、甘草等十味藥物組成，臨床用于治療銀屑病，效果良好。為確保療效，更好的服務于臨床，本實驗以HPLC-PDA建立了測定銀屑靈流膏中綠原酸、芍藥苷、異秦皮啶、阿魏酸和落新婦苷5個成分含量的方法，可用于銀屑靈制劑的質量控制。

1 實驗部分

1.1 儀器 美國Waters高效液相色譜儀，包括600四元梯度泵、2998 Photodide Arryay Detector、717 plus Autosample和Empower工作站;電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司);超純水機(Milipore公司);離心機(G 20河北省安新縣白洋離心機廠);超聲儀(BOLONG上海波龍電子設備有限公司)。

1.2 試藥與試劑 銀屑靈流膏由本實驗室自制;綠原酸(110753-200413)、芍藥苷(0736-9913)、異秦皮啶(110837-200304)、阿魏酸(0773-9910)均購自中國藥品生物制品檢定所;落新婦苷購自廣州醫藥工業研究所(批號:0901231);甲醇(天津四友精細化學品有限公司，HPLC級);無水乙醇(天津市大茂化學試劑廠AR);冰醋酸(天津市科密歐化學試劑有限公司，HPLC級)。

1.3 供試品溶液制備 銀屑靈方以水常規提取濃縮后得流膏(含藥材2.9 g/mL)，精密量取流膏0.5 mL，加入10倍量的無水乙醇，充分混合使沉淀，3 000 r/min離心5 min，傾取上清液，殘渣用無水乙醇洗滌兩次，每次1mL，合并醇液，65℃水浴蒸干，殘渣以甲醇-0.1%冰醋酸(70∶30)溶液溶解成10 mL，0.45 μm微孔濾膜濾過，濾液作供試品溶液。

1.4 對照品溶液配制 取綠原酸、異秦皮啶、落新婦苷、芍藥苷、阿魏酸適量，精密稱定，以甲醇溶解并定容至10 mL，作貯備液。精密量取各標準品貯備液，以甲醇-0.1%冰醋酸(70:30)溶液配制成含綠原酸 10.62 μg/mL、異秦皮啶 3.85 μg/mL、阿魏酸3.28 μg/mL、落新婦苷26.30 μg/mL、芍藥苷139.79 μg/mL的混合溶液10 mL作對照品溶液。

1.5 色譜條件 Kromasil 100-5 C18色譜柱，流動相為甲醇-0.1%冰醋酸，0～10 min(10 ∶90～30 ∶70)，10～40 min(30 ∶70～40 ∶60);流速為 1.0 mL/min;綠原酸、異秦皮啶、阿魏酸檢測波長為320 nm，落新婦苷為289 nm，芍藥苷為230 nm;進樣體積10 μL;柱溫為室溫。

2 結果

2.1 系統適應性 取對照品溶液和供試品溶液，各進樣10 μL，記錄色譜圖，結果5種成分與其它成分均達到基線分離，見圖1，圖2。

圖1 HPLC色譜圖(320 nm)A.混合對照品 B.供試品 C.陰性樣品(處方中除去當歸、川芎、生地、金粟蘭、土茯苓、烏梅等含以上成分的藥材)1.綠原酸 2.異秦皮啶 3.阿魏酸 4.落新婦苷Fig.1 HPLC chromatogram(320 nm)A.the mixture of chemical reference substance B.sample C.negative sample 1.chlorogenic acid 2.isofraxidin 3.ferulaic acid 4.astilbin

2.2 色譜峰確認 取5種標準品貯備溶液各20 μL，混合后稀釋至1 mL，按1.5項色譜條件進樣10 μL，記錄結果，在所得的色譜圖上提取各成分的PDA特征光譜圖，并添加到新建的“銀屑靈對照品”光譜庫。取供試品溶液進樣10 μL，將所得的HPLC色譜與“銀屑靈對照品”光譜庫進行譜庫匹配處理，結合保留時間和匹配結果確認樣品中的色譜峰。

2.3 線性關系考察 取1.4項下配制的混合對照品溶液，分別進樣2.5、5、10、20、30 μL，按2.1 項中的色譜條件測定5種成分的峰面積，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線并進行回歸，計算回歸方程，見表1。

2.4 精密度實驗 取供試品混合溶液，重復進樣6次，每次10 μL，以各物質峰面積計算，RSD值分別為:綠原酸1.77%，異秦皮啶 2.35%，阿魏酸1.62%，落新婦苷1.72%，芍藥苷2.35%，表明精密度良好。

圖2 HPLC色譜圖(230 nm)A.芍藥苷對照品 B.供試品 C.陰性樣品(處方中除去赤芍)Fig.2 HPLC chromatogram(230 nm)A.peoniflorin reference substance B.sample C.negative sample

表1 線性試驗結果Table 1 Results of linear test

2.5 穩定性實驗 取同一供試品溶液，室溫放置，分別于 0、1.5、5.5、8.5、10、15 h 進樣10 μL，測定峰面積，結果RSD值分別為綠原酸3.03%，芍藥苷2.86%，異秦皮啶1.80%，阿魏酸1.94%，落新婦苷2.65%，說明供試品在15 h內穩定。

2.6 加樣回收實驗 精密量取已測定含量的銀屑靈流膏9份，每份0.5 mL，分低、中、高3個劑量組分別加入各成分對照品適量，每組3份，按上述樣品處理方法處理，測定。計算各劑量組樣品的平均回收率和RSD，結果見表2。

表2 5種成分的提取回收率(n=3)Table 2 Recoveries of five components(n=3)

2.7 重復性實驗 取同一批樣品6份，按上述方法測定，各成分的RSD分別為:綠原酸0.09%，芍藥苷1.24%，異秦皮啶0.26%，阿魏酸1.70%，落新婦苷2.46%，說明方法重現性較好。

2.8 樣品測定 精密量取3個批次的銀屑靈流膏樣品每批3份，每份0.5 mL，以上述方法測定，結果見表3。

表3 樣品測定結果(n=3)Table 3 Determination results of samples(n=3)

3 討論

銀屑靈處方藥味眾多，其中的化學成分復雜，成分間性質差異大，為了使各成分達到良好的分離，在方法建立過程中，主要對流動相組成及洗脫方式進行了篩選。我們以甲醇、乙腈、0.1%冰醋酸溶液、0.1%磷酸溶液、0.08%醋酸銨溶液以及水等進行了不同組合的篩選，在洗脫方式上，我們實驗了等度及不同梯度對樣品分離的比較，結果以甲醇-0.1%冰醋酸梯度洗脫分離較理想，因此最終確定該色譜方法。

基于不同成分紫外吸收特征的不同，為了提高檢測靈敏度，在定量時我們采用了物質的最大吸收波長或與之相接近的波長作為檢測波長，如芍藥苷選擇了230 nm用作定量時的波長，落新婦苷選擇289 nm，取得了理想的結果。

HPLC法在藥物質量控制中的應用非常普遍，但對于成分復雜的樣品，在達到較好分離后，由于色譜峰眾多，分布密集，tR大多非常接近，單以tR與對照品一致的方法對各成分進行辨識存在較大的不確定性。光電二極管陣列檢測器(photodiode array;PDA)是HPLC最常用的檢測器之一，該檢測器可以獲得色譜中各組分的吸收光譜。PDA光譜目前已廣泛用于色譜峰的純度檢查、定性分析、選擇被測成分最大吸收波長以及建立藥物多個特征吸收波長下的指紋圖等，大大拓展了PHLC的應用范圍［1-3］。本實驗在樣品測定中采用PDA譜-庫匹配處理，以色譜和光譜雙重標準對各成分進行了識別與歸屬，保證了樣品中成分的色譜峰光譜與對照品一致，提高了方法的專屬性。

4 結論

本實驗建立的方法同時測定了銀屑靈復方流膏中5種成分，該法方便，準確，重復性好，各成分分離度較好，可用于銀屑靈制劑及其中間產品的質量控制。

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