蒙藥那如-3丸對佐劑性關節炎的治療作用及機制

白梅榮， 圖 雅， 巴根那， 包曉華

(內蒙古民族大學，蒙醫藥學院，內蒙古通遼028041)

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性全身性自身免疫性疾病，病因不明，嚴重危害著人類的身體健康［1－3］。至今尚無理想的抗類風濕性關節炎藥物，開發標本兼治、安全有效的藥物有著重要的實際價值。蒙藥復方那如－3丸，又稱那如蘇木珠爾，處方出自《至高要方》，是蒙醫臨床治療黃水病的首選方劑。由訶子、制草烏、蓽茇配伍組成。味澀辛，性溫，具有祛黃水、殺“黏”、消腫、止痛功能，主治關節痛、黃水病、蟲病、白喉、炭疽等粘性疾病及腰腿疼痛等［4］，臨床效果可佳。本研究就觀察那如－3對佐劑性關節炎(adjuvant arthritis，AA)大鼠模型的治療作用，并探討了其可能的作用機制，為將那如－3開發為治療RA的有效藥物提供理論依據和研究基礎。

1 實驗材料

1.1 實驗試劑和藥品 弗氏完全佐劑(批號122k8945)，sigma公司產品，由北京拜爾迪公司提供。

雷公藤片(批號040705):三九黃石制藥廠產品。

那如－3丸(批號20060113)，由內蒙古民族大學附屬醫院制劑室制備。

SOD(批號 20080221)、MDA(批號 20080113)、NO(批號 20080310)、IL－1β(批號 20080203)、TNF－a(批號20080126)、PGE(批號20080312)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗動物 清潔級Wistar大鼠75只，體重為(180±10)g，♀♂兼用;清潔級昆明種小鼠75只，體重為(20±2)g，♀♂兼用。由沈陽醫學院實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號:SCXK(遼)2003－00160

2 方法及結果

2.1 對大鼠佐劑致繼發性足腫脹的影響 取大鼠75只，♀♂兼用，按體重隨機分為5組，分別為正常對照組、模型組、那如－3丸大劑量組、那如－3丸小劑量組、雷公藤片組，每組15只。建立模型前用容積法測量各組大鼠左右足容積。除正常對照組外，給各組大鼠右后足足跖皮內注射Freunds完全佐劑0.1 mL致炎。第5天同量再加強注射1次。致炎后第15天開始，各給藥組灌胃相應藥的0.5%羧甲基纖維素鈉混懸液，正常對照組和模型組灌胃0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液，給藥體積均為2 mL/100 g。每日1次，一直給到第26天。同時觀察記錄致炎后第12天、15天、18天、21天和24天各組大鼠右后足跖腫脹度，在第1次致炎后第26天依次進行如下處理:

(1)斷頭取血，在37℃保溫30 min，再置4℃冰箱40 min，(2 000 r/min離心10 min，取血清，轉移至2 mL具塞塑料離心管中，置超低溫冰箱(－45℃)中，備用于測定血清SOD和MDA;

(2)取其右后足關節上1 cm以下部位，剪碎后放入盛有5 mL生理鹽水的具塞離心管中，過夜。離心，取上清液，轉移至5 mL具塞塑料離心管中，置超低溫冰箱(－45℃)中，備用于測定關節組織中IL－1β、TNF－a、PGE 和 NO、SOD、MDA 含量。按照試劑盒說明嚴格操作，在放射免疫測定儀上測定IL－1β和TNF－a的含量;PGE2按照文獻方法進行測定;在紫外－可見分光光度儀上測定NO含量。結果見表1～4。

2.2 對大鼠脾淋巴細胞增殖的影響 佐劑致大鼠繼發性關節炎大鼠第一次致炎后第26天斷頭取血、取關節后，每組隨機抽取12只大鼠，無菌操作，打開腹腔取出脾臟，制備大鼠脾細胞懸液，加入96孔培養板，200 μL/孔，使終濃度為 5 ×106/mL，細胞懸液數，每個供試品分裝6個孔，其中3孔為對照組不加ConA，另3孔加入 ConA(5 mg/mL)，置37℃，5%CO2培養箱，溫育44 h后，每孔加入 MTT(5 mg/mL)繼續溫育4 h，終止培養，離心(1 500 r/min)5 min，棄去上清液，晾干后加入0.04 mo1/L鹽酸異丙醇100 μL，充分混勻，于酶標儀上檢測波長570 nm下的吸光度(A值)，以A值表示細胞的增殖反應能力。結果見表5。

2.3 結果

2.3.1 對大鼠佐劑致繼發性足腫脹的影響 模型組大鼠足容積自致炎第15天起有明顯的腫脹，一直到第24天與正常對照組比較均有顯著差異，其中第18天時達高峰。說明佐劑引起的繼發性關節炎模型建立成功。各給藥組也有不同的腫脹，但第15天至第24天的足容積與模型組比較，明顯下降，有顯著差異(P＜0.05)。結果見表1。

2.3.2 對大鼠關節組織中白芥素－1β和腫瘤壞死因子－a的影響 與正常對照組相比，模型組關節組織 IL－1β、TNF－a含量明顯升高(P ＜0.01)。與模型組相比，那如－3大、小劑量組和雷公藤片組關節組織 IL－1β、TNF－a 含量均明顯下降(P ＜ 0.05、P ＜0.01)。結果見表2。

2.3.3 對大鼠關節組織中前列腺素和一氧化氮的影響 與正常對照組相比，模型組關節組織PGE、NO含量明顯升高(P＜0.01)。與模型組相比，那如－3丸大、小劑量組和雷公藤片組關節組織PGE、NO含量均明顯下降(P＜0.05、P＜0.01)。結果見表3。

2.3.4 對大鼠足關節中超氧化物歧化酶和丙二醛的影響 與正常對照組相比，模型組血清SOD、MDA含量無明顯變化，無統計學意義(P＞0.05)。與模型組相比，那如－3丸大、小劑量組和雷公藤片組血清SOD、MDA含量無明顯變化，無統計學意義(P＞0.05)。結果見表4。

表1 那如-3丸對大鼠佐劑致繼發性足腫脹的影響(±s，n=15)

表1 那如-3丸對大鼠佐劑致繼發性足腫脹的影響(±s，n=15)

與模型組比較*P＜0.05。

組別 劑量/(g/kg·d)致炎后不同時間足腫脹率/%12 d 15 d 18 d 21 d 24 d正常對照組模型組那如－3丸大劑量組那如－3丸小劑量組雷公藤片組－－0.4 0.8 0.52 1.33±0.15 1.40±0.11 1.38±0.11 1.37±0.14 1.39±0.13 1.35±0.15*1.53±0.09 1.45±0.10*1.43±0.14*1.46±0.10*1.37±0.15*1.60±0.09 1.51±0.10*1.51±0.13*1.53±0.09*1.39±0.14*1.57±0.10 1.45±0.09*1.45±0.08*1.47±0.09*1.40±0.14*1.56±0.10 1.45±0.09*1.45±0.08*1.47±0.10*

表2 那如-3丸對佐劑性關節炎大鼠足關節中IL-1β、TNF-a的影響(±s，n=14)

表2 那如-3丸對佐劑性關節炎大鼠足關節中IL-1β、TNF-a的影響(±s，n=14)

與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 劑量/(g/kg·d) 樣本數/只 IL－1β含量/(ng/mL) TNF－a含量/(ng/mL)正常對照組 － 14 0.148±0.056** 1.128±0.704**模型組 － 14 0.268±0.172 3.450±1.201那如－3丸大劑量組 0.4 14 0.140±0.043** 2.325±1.097**那如－3丸小劑量組 0.8 14 0.139±0.050** 2.126±1.375**雷公藤片 0.52 14 0.174±0.097** 2.573±2.165*

表3 那如-3丸對佐劑性關節炎大鼠足關節中PGE、NO的影響(±s，n=14)

表3 那如-3丸對佐劑性關節炎大鼠足關節中PGE、NO的影響(±s，n=14)

與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

NO正常對照組 － 14 0.181±0.063** 14.80±11.87組別 劑量/(g/kg·d) 樣本數/只 PGE2**模型組 － 14 0.442±0.089 40.90±24.68那如－3丸大劑量組 0.4 14 0.347±0.055** 21.39±12.68**那如－3丸小劑量組 0.8 14 0.335±0.043** 17.47±10.20**雷公藤片 0.52 14 0.355±0.068** 24.53±9.258*

表4 那如-3丸對佐劑性關節炎大鼠足關節中SOD、MDA的影響(±s，n=14)

表4 那如-3丸對佐劑性關節炎大鼠足關節中SOD、MDA的影響(±s，n=14)

組別 劑量/(g/kg·d) 樣本數/只 SOD/(U/mL) MDA/(nmol/mL)正常對照組 －14 79.27±37.33 3.494±1.340模型組 － 14 69.21±47.89 3.346±0.965那如－3丸大劑量組 0.4 14 72.18±35.38 3.450±0.687那如－3丸小劑量組 0.8 14 63.12±37.04 2.885±0.612雷公藤片0.52 14 78.16±40.03 4.129±0.511

2.3.5 對大鼠脾淋巴細胞增殖的影響 與正常對照組相比，模型組大鼠脾淋巴細胞增殖能力有所提高，差異顯著(P＜0.01)。與模型組相比，各給藥組對脾淋巴細胞增殖有抵抗作用，差異顯著(P＜0.05)。見表5。

3 討論

AA是一種免疫性炎癥模型，該模型繼發性病變表現為以多發性關節炎為特征的全身遲發性超敏反應［5］。為探討那如－3丸對大鼠AA的治療作用，于繼發性反應出現時開始灌胃給藥，結果發現，劑量為0.4、0.8 g/(kg·d)，能夠明顯抑制繼發性足腫脹，對大鼠AA有明顯改善作用。

RA是一種全身性異質性自身免疫性疾病，研究表明在RA發病過程中細胞因子網絡的失調，即促炎細胞因子(如IL－l、IL－6、TNF－a)和抗炎細胞因子(如 IL－10)的不平衡占有重要地位［6－8］。PGE2可以參與炎癥反應;SOD的活性和MDA的水平與脂質過氧化、炎癥等機體多種狀況有關。因此，測定以上指標對抗類風濕性關節炎藥效機制的研究和闡明具有一定作用［9－11］。

表5 那如-3丸對佐劑性關節炎大鼠脾淋巴細胞增殖的影響(±s，n=15)

表5 那如-3丸對佐劑性關節炎大鼠脾淋巴細胞增殖的影響(±s，n=15)

與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

吸光度值正常對照組 － 12 0.091±0.059組別 劑量/(g/kg·d)樣本數/只**模型組 － 12 0.240±0.070那如－3丸大劑量組 0.4 12 0.123±0.045*那如－3丸小劑量組 0.8 12 0.108±0.053*雷公藤片 0.52 12 0.115±0.026*

實驗結果表明，AA組大鼠經弗氏完全佐劑刺激后，產生的 IL－l、TNF－a水平明顯升高，阻抑由它們介導的關節炎癥(降低PGE2和NO含量)，降低關節腫脹度(P＜0.05)，同時發現，經弗氏完全佐劑誘導的AA大鼠脾淋巴細胞增殖反應增強，而不同劑量的那如－3可以明顯下調AA大鼠升高的脾淋巴細胞增殖反應。

綜上所述，那如－3丸對AA大鼠具有明顯的治療作用，其作用機制可能與調節機體異常的免疫功能和維持細胞因子網絡平衡有關。此結果為將那如－3丸開發為治療人類RA的新藥提供了初步的實驗依據。

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