復方雞血藤膏的質量標準研究

吳 融， 盧 燕， 陳道峰

(復旦大學藥學院生藥學教研室，上海201203)

復方雞血藤膏為一傳統的婦科良藥，始創于清道光年間，現收載于《中國藥典》(2005年版一部)，由滇雞血藤膏粉(218.75 g)、川牛膝(59.5 g)、續斷(53 g)、紅花(5 g)和黑豆(12.5 g)配伍，以糯米(437.5 g)、飴糖(300 g)為輔料制成，功能補血、活血、調經，用于血虛、手足麻木、關節酸痛和月經不調等癥。由于基礎研究薄弱，現行藥典中復方雞血藤膏項下僅規定了制劑性狀及專屬性很差的香豆素類、酚類化合物的顯色反應，缺乏方中各味藥的特征性鑒別和指標成分的含量測定［1］。方中君藥滇雞血藤膏粉為滇雞血藤(木蘭科內南五味子Kadsura interior A.C.Smith的藤莖)的水提干浸膏粉，處方劑量約為其他四味藥原藥材總量的2倍，是復方雞血藤膏質量控制研究的重點。我們的前期研究發現，聯苯環辛烯類木脂素是滇雞血藤的主要活性成分，其中異型南五味子丁素(heteroclitin D)含量高、活性強，具有抗氧化、鈣拮抗、抑制血小板聚集等與藥材傳統功效一致的藥理作用，可作為滇雞血藤及其復方制劑質量控制的指標成分［2-5］。為了有效鑒別和質量控制，本實驗建立了制劑中滇雞血藤、川牛膝和續斷三味主藥的特征性TLC鑒別方法，并采用HPLC方法建立了異型南五味子丁素的含量測定方法，為完善復方雞血藤膏這一傳統中藥制劑的質量標準提供了參考依據。

1 儀器與試藥

Agilent HP1100型高效液相色譜儀，DAD檢測器;SHANGPING FA1004天平(上海天平儀器廠);ZX-91旋轉蒸發儀(中國科學院上海有機化學所);電熱恒溫水浴鍋(上海醫療器械五廠);DHG型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海華連醫療器械有限公司);DL-360超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司);硅膠GF254、硅膠G薄層板(煙臺市芝罘黃務硅膠試驗廠);HPLC測定用甲醇、乙腈為色譜純，水為市售純凈水;其他試劑均為分析純。

對照品異型南五味子丁素(丁素)為自制，經IR、MS、1HNMR、13CNMR 確定其化學結構，純度經HPLC-ELSD法測定大于98%;川牛膝對照藥材(1065-200002)、續斷對照藥材(121033-200306)購于中國藥品生物制品檢定所;8批復方雞血藤膏樣品 (20031201，20050601，20050801，20060919，20061101，20070106，20070701，20080301)和滇雞血藤對照藥材由云南廣福藥業有限公司提供，對照藥材經鑒定為內南五味子K.interior A.C.Smith的藤莖。

TLC鑒別用陰性對照樣品照《中國藥典》(2005年版一部)規定的復方雞血藤膏相同工藝按處方量1/20取樣自制;其中滇雞血藤膏粉為內南五味子K.interior的干燥藤莖經加工制成的浸膏粉，由云南廣福藥業有限公司提供;川牛膝為莧科植物川牛膝Cyathula officinalis kuan的干燥根，續斷為川續斷科植物川續斷Dipsacus asperoides C.Y.Cheng et T.M.Ai的干燥根，紅花為菊科植物紅花Carthamus tinctorius L.的干燥花，黑豆為豆科植物大豆Clycine max(L.)Merr.的干燥的黑色種子，該四味藥材均購自上海華宇藥業有限公司。

2 方法與結果

2.1 TLC定性鑒別

2.1.1 滇雞血藤的TLC鑒別 取本品粉末5 g，加熱水50 mL溶解，放冷，取上清液用乙酸乙酯振搖提取3次，每次50 mL，合并乙酸乙酯溶液，蒸干，殘渣加乙酸乙酯0.5 mL使溶解，作為供試品溶液。取缺滇雞血藤的復方雞血藤膏陰性對照樣品5 g，同法制成陰性對照溶液。另取滇雞血藤對照藥材2 g，加熱水50 mL，同法制成對照藥材溶液。再取異型南五味子丁素對照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2005年版一部附錄ⅥB)試驗，吸取上述4種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以環己烷-乙酸乙酯(2 ∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照色譜無干擾。結果見圖1。

圖1 滇雞血藤的TLC鑒別圖譜

2.1.2 川牛膝的TLC鑒別 取本品粉末5 g，加甲醇50 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，加水10 mL溶解，用乙醚振搖提取2次，每次10 mL，合并乙醚液，蒸干，殘渣加三氯甲烷0.5 mL使溶解，作為供試品溶液。取缺川牛膝的復方雞血藤膏陰性對照樣品5 g，同法制成陰性對照溶液。另取川牛膝對照藥材0.2 g，加甲醇10 mL，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2005年版一部附錄ⅥB)試驗，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(3∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照色譜無干擾。結果見圖2。

圖2 川牛膝的TLC鑒別圖譜

2.1.3 續斷的TLC鑒別 取本品粉末5 g，加甲醇50 mL超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取缺續斷的復方雞血藤膏陰性對照樣品5 g，同法制成陰性對照溶液。另取續斷對照藥材0.2 g，加甲醇10 mL，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2005年版一部附錄Ⅵ B)試驗，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇(4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以香草醛硫酸試液，加熱至顯色明顯。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同的淡紫紅色斑點，陰性對照色譜無干擾。結果見圖3。

2.2 HPLC含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱:YMC ODS-H80 4 μm(250 mm×4.6 mm ID);預柱:Phenomenex C18(4 mm L×3.0 mm ID);流動相為甲醇-乙腈-水(10 ∶48∶42);流速:1 mL/min;柱溫:35℃;檢測波長:230 nm。在此色譜條件下，異型南五味子丁素峰與前后峰分離度大于1.5，理論板數大于10 000，溶劑峰、陰性對照均無干擾，結果見圖4。

圖3 續斷的TLC鑒別圖譜

圖4 復方雞血藤膏HPLC色譜圖

2.2.2 線性關系考察 取異型南五味子丁素對照品，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.144 mg的溶液，作為對照品貯備液。精密吸取對照品貯備液5、7、10、20、50、100、200 μL，分別加甲醇稀釋定容至 1 mL，作為對照品稀釋液。精密吸取上述稀釋液各20 μL，進樣，以峰面積 A對進樣濃度 C(μg/mL)求得線性回歸方程。結果表明丁素在0.72 μg/mL～28.8 μg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系，線性方程為 A=6.64×104C－0.104，相關系數為0.999。

2.2.3 供試品及陰性對照溶液的制備 取本品研細，過五號篩，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入環己烷50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理50 min，放冷，再稱定重量，用環己烷補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液25 mL，蒸干，殘渣用甲醇溶解，轉移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，作為供試品溶液。精密稱取缺滇雞血藤的復方雞血藤膏陰性對照樣品粉末0.5 g，同法制成陰性對照溶液。

2.2.4 檢測限和定量限考察 采用信噪比法，進空白溶劑后，測出噪音，進已知濃度的對照品，根據其對應的峰高值，將對照品溶液稀釋至約3、10倍信噪比高度的濃度，即為檢測限與定量限。所得檢測限為7.2×10－8g/mL;定量限為2.74×10－7g/mL(n=6，RSD值為2.7%)。

2.2.5 精密度試驗 取同一份對照品溶液(對照品貯備液稀釋50倍)，按2.2.1項下色譜條件連續進樣6次，每次20 μL，異型南五味子丁素峰面積的RSD值為2.2%;取批號為20070106的樣品粉末(過五號篩)，按2.2.3項下方法制備供試品溶液，重復進樣6次，丁素峰面積RSD值為1.0%，表明方法精密度良好。

2.2.6 穩定性試驗 取2.2.5項下同一供試品溶液，分別于 0、2、4、6、8、12 h 及1、2、3、4、5、6 d 進樣，每次20 μL，計算異型南五味子丁素含量，結果顯示同一天12 h內丁素含量的RSD值為1.2%，6 d內RSD值為2.0%，表明供試品溶液穩定性良好。

2.2.7 重復性試驗 取批號為20070106的樣品粉末(過五號篩)，按2.2.3項下方法，平行制備6份供試品溶液，測定異型南五味子丁素的含量，平均含量為33.2 μg/g，RSD值為2.8%，表明方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密吸取濃度為0.144 mg/mL的對照品溶液60 μL，加至具塞錐形瓶中，共6份;于水浴上蒸干后，取批號為20070106的樣品粉末(過五號篩)6份，每份約0.25 g，精密稱定，加入上述具塞錐形瓶中，按2.2.3項下方法，平行制備6份供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件測定異型南五味子丁素的含量，計算加樣回收率，結果見表1。平均加樣回收率為101.9%，RSD值為2.8%。

2.2.9 耐用性考察 采用3根不同廠家的色譜柱按2.2.1項下色譜條件對同一供試品溶液進行分離，并計算異型南五味子丁素的含量，結果見表2。3根色譜柱的測定結果無明顯差異，RSD值為0.29%，表明方法耐用性良好。

表1 復方雞血藤膏中異型南五味子丁素含量測定的加樣回收率實驗結果

表2 不同型號色譜柱的耐用性試驗

2.2.10 異型南五味子丁素的含量測定 精密吸取對照品貯備液5 μL、50 μL，分別用甲醇稀釋定容至1 mL，作為隨行對照品溶液。取各批次復方雞血藤膏樣品，按2.2.3項下方法，制備供試品溶液。分別精密吸取隨行對照品溶液與供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定異型南五味子丁素的含量，并按干燥品計算樣品的異型南五味子丁素含量(結果見表3)。

表3 復方雞血藤膏中異型南五味子丁素的含量測定結果(n=2)

3 討論

3.1 除內南五味子外，同屬植物異型南五味子K.heteroclita(Roxb.)Craib和五味子屬植物鐵箍散Schisandra propinqua(Wall.)Bail var.intermedia A.C.Smith的藤莖在民間均作為熬制“滇雞血藤膏”的原料［6］，但以內南五味子品質好、產量大。為了保證質量的穩定性，本實驗建立的滇雞血藤TLC鑒別方法同時以活性成分異型南五味子丁素和內南五味子藤莖為對照，特征明顯、專屬性強。由于川牛膝、續斷活性成分不明確，這兩味藥的TLC鑒別僅采用對照藥材為對照。經驗證，本實驗所建立的三味主藥的TLC鑒別方法對于溫度、濕度和不同廠家薄層板均有良好的耐用性。

3.2 滇雞血藤中活性木脂素類成分結構復雜多樣，水溶性較低，木脂素類成分HPLC分析常用的甲醇-水或乙腈-水很難在短時間內將異型南五味子丁素與其他成分完全分離，本實驗經多次條件優化確定了甲醇-乙腈-水(10 ∶48 ∶42)的流動相組成，丁素峰的分離度大于1.5，保留時間25 min左右，并根據文獻［7-8］的研究結果，采用環己烷為提取溶劑，通過對提取方法、提取時間和溶劑用量的考察，最終確定了供試品溶液的制備方法。

3.3 對8批復方雞血藤膏樣品進行了干燥失重檢查，各批樣品的減失重量為7.73% ～11.76%，符合《中國藥典》2005年版復方雞血藤膏項下規定。為了增加數據的可比性，以干燥品計算了各批樣品中的異性南五味子丁素含量，結果見表3。

3.4 HPLC含量測定結果顯示，8批復方雞血藤膏中丁素含量差異較大，說明采用現行藥典標準中簡單的性狀和化學反應定性鑒別難以控制質量和藥效的穩定性。滇雞血藤膏粉傳統的水提制備工藝對丁素等木脂素類有效成分的提取率較低(采用本實驗的HPLC方法測定，丁素含量僅為0.001 7%-0.028%)，加上輔料糯米和飴糖的大量應用(總膏量的70%以上)，造成復方雞血藤膏中丁素含量很低，本實驗所測的8批樣品中含量最高的以干燥品計也不到0.005 0%。另外，復方雞血藤膏劑型落后，需用水、酒各半燉化服用，非常不方便。因此，需要對復方雞血藤膏進行制備工藝和劑型改良，以利于提高原料利用率、減小用量和便于服用，更好地發揮這一古老制劑的獨特療效。

［1］中國藥典［S］.一部.2005:531.

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［8］郁韻秋，陳道峰，司徒冰.高效液相色譜法測定內南五味子的木脂素含量［J］.藥物分析雜志，1996，16(5):313-316.