枳殼中脂溶性部位有效成分提取工藝的研究

陳海芳， 魏 玲， 袁金斌， 王發英， 黎艷剛， 涂明珠， 楊武亮

(江西中醫學院現代中藥制劑教育部重點實驗室，江西南昌330004)

枳殼為蕓香科植物酸橙(Citrus aurantium L.)及其栽培變種的干燥未成熟果實，具有理氣寬中，行滯消脹的功效［1］。為了進一步探討枳殼中理氣作用的活性化學成分，筆者對枳殼脂溶性部位提取物進行了進一步的研究，初步表明脂溶性部位提取物對胃腸平滑肌有雙向調節作用，小劑量對正常小鼠胃腸運動有促進作用，大劑量則有抑制作用。枳殼中脂溶性部位成分主要為多甲氧基黃酮和香豆素類有效成分，文獻報道這些脂溶性成分對肺癌、結腸癌、胃癌［2-5］等多種癌細胞株等具有較強的抑制作用，以及抗菌、抗氧化、神經保護活性［6-8］。為了有效開發和利用枳殼，本實驗主要以枳殼中的meranzin hydrate、馬爾敏、川陳皮素、紅橘素和葡萄內酯的含量以及脂溶性部位浸膏得率為評價指標，采用L9(34)正交實驗對枳殼的脂溶性部位化學成分的提取工藝進行了研究，以期為枳殼中脂溶性部位成分的大規模化生產工藝提供理論依據。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀(包括四元泵、柱溫箱、VWD檢測器和 Agilent 1200色譜工作站);瑞士梅特勒AE-240十萬分之一電子天平。

1.2 試藥 甲醇為色譜純(Merk公司);其它試劑均為分析純;水為重蒸水。meranzin hydrate、馬爾敏、川陳皮素、紅橘素和葡萄內酯等對照品均為自制，結合光譜(1H-NMR，13C-NMR以及ESI-MS)確定結構，HPLC峰面積歸一化法計算質量分數≥98%。枳殼樣品采自江西新干，由江西中醫學院楊武亮教授鑒定為新干臭橙枳殼。

2 實驗方法

2.1 色譜條件

色譜柱:Diamonsil C18(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:甲醇(A)-水(B)梯度洗脫，A:0～7 min，51%;7～9 min，59%;9～14 min，60%;14～15 min，64%;15～25 min，64%;25～29 min，95%;29～30 min，100%;30～36 min，100%;流速:1 mL/min;柱溫:30℃;檢測波長:324 nm;進樣量10 μL;理論塔板數按照meranzin hydrate計算應不低于5 000，色譜圖見圖1。

2.2 對照品溶液的配制

取meranzin hydrate、馬爾敏、川陳皮素、紅橘素和葡萄內酯適量，精密稱定，同置于50 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，靜置，制成混合對照品標準溶液，其中含 meranzin hydrate 427.4 μg/mL、馬爾敏170.6 μg/mL、川陳皮素 206.8 μg/mL、紅橘素208.0 μg/mL、葡萄內酯 203.8 μg/mL。

2.3 線性范圍考察

分別精密吸取此混合標準溶液0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0 mL置于25 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻。在上述色譜條件下，分別進樣10 μL，測定峰面積。以對照品濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，計算回歸方程。結果見表1。

圖1 對照品(A)和供試品(B)的HPLC圖

表1 標準品的線性方程

2.4 精密度測定

精密吸取同一濃度的混合對照品溶液，連續進樣6 次，每次10 μL，以 meranzin hydrate、馬爾敏、川陳皮素、紅橘素和葡萄內酯的峰面積計算，RSD分別為2.14%、2.20%、2.14%、2.19%、2.48%(n=6)，結果表明精密度良好。

2.5 供試品制備

取枳殼粗粉約10 g，精密稱定，采用水浴回流法，按照實驗設計進行提取，趁熱過濾，減壓濃縮至干，得總浸膏。總浸膏以50 mL水溶解分散成懸浮液，以50 mL氯仿萃取3次，萃取液合并，減壓濃縮至干，得脂溶性部位浸膏，稱重，并計算得率。

2.6 供試品測定

將上述所得脂溶性部位浸膏以甲醇溶解，置于50 mL量瓶中，定容，搖勻，過0.45 μm膜，取續濾液作供試品溶液。上述色譜條件下，分別進樣10 μL，測定，計算5種脂溶性成分的含量，并以5種成分的含量之和作為樣品脂溶性部位成分含量的指標。

2.7 正交實驗

在實際操作中，提取效果往往受到多因素的影響，為了全面考察提取效果，本研究以乙醇濃度、料液比、提取時間和提取次數為考察因素，選用L9(34)正交表對枳殼中的脂溶性部位成分提取工藝進行篩選，詳見表2。

表2 脂溶性部位成分提取正交實驗因素水平表

表3 L9(34)正交實驗

3 實驗結果

3.1 極差分析 從表3可以看出，以脂溶性部位化學成分的含量為考察指標，各因素影響大小依次為:D＞B＞C＞A，即提取次數對提取的影響較大，其次是物料比，提取時間和乙醇濃度;以脂溶性部位浸膏得率為考察指標，各因素的作用主次為A＞D＞C＞B，即依次為乙醇濃度，提取次數，提取時間，物料比。

3.2 方差分析 將所得實驗結果進行方差分析，結果見表4和表5。方差分析結果表明:以脂溶性部位化學成分的含量為考察指標，提取次數有顯著影響(P＜0.05)，其他因素無顯著意義(P＞0.05)，以A3B2C2D2為佳;以脂溶性部位浸膏得率為考察指標，四種因素均無顯著影響(P＞0.05)，以A3B2C2D3為佳。

從表2中因素的K值來看，85%和95%乙醇的提取效果以及提取2次和3次的效果相差并不大，從大工業生產和節約成本上考慮，以85%、提取2次為宜。因此根據極差和方差分析結果，枳殼脂溶性部位成分優化后的工藝定為A2B2C2D2，即:乙醇濃度85%、料液比1 ∶8、提取時間1 h，提取2次。

3.3 正交實驗驗證 為進一步驗證優選方法的可靠性，取3份藥材，按照篩選出的工藝進行提取，計算脂溶性部位各指標成分的含量及脂溶性部位浸膏得率，3次平行驗證性實驗表明脂溶性部位成分的平均含量為2.86(mg/g)，RSD為1.32%，脂溶性部位浸膏的平均得率為2.81%，RSD為1.78%，具體見表6，表明該工藝穩定、可行、重復性好。

表4 脂溶性部位成分含量方差分析

表5 脂溶性部位浸膏得率方差分析

表6 正交實驗驗證(n=3)

4 討論

4.1 本實驗首次對枳殼的脂溶性部位成分提取工藝進行了研究，該提取工藝簡單，條件易控制，提取率高，可為枳殼的脂溶性部位成分的制備及大規模生產提供理論依據。

4.2 本實驗采用了單因素實驗考察了乙醇濃度、物料比、提取時間和提取次數四個因素，選取因素中脂溶性部位成分的含量及脂溶性部位浸膏得率較高的三個條件作為正交實驗水平設計的參考依據。

4.3 萃取次數對脂溶性成分萃取率的影響 按照優化后的提取工藝，做3個平行實驗，分別萃取4次，測定氯仿相和水溶液里殘留的脂溶性成分的量，計算其萃取率，依次為 63.1%、22.6%、7.9%、3.4%，水里殘留有3.0%的脂溶性成分的含量。據此可以看出，氯仿萃取3次可萃取出含93%以上的脂溶性成分，從生產成本上考慮，以氯仿萃取3次為宜。

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