不同轉移特性的人鼻咽癌細胞株中Tiam-1表達及其意義

張香梅 陳培芬 劉 芳

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國南方及東南亞地區常見的1種惡性腫瘤，尤以廣東省珠江三角洲一帶多見，俗有“廣東癌”之稱。雖然近年來鼻咽癌的診斷和治療水平已有很大提高，但鼻咽癌的5年生存率仍很低，究其原因，轉移是導致鼻咽癌患者治療效果和死亡的關鍵[1]。目前已發現與鼻咽癌轉移有關的分子標志物主要有VEGF、CXCR4、CD44、Cadherin、MMP、nm-23、Wt-p53等[2]，有關T淋巴瘤侵襲轉移誘導因子1(T lymphoma invasion and metastasis inducing factor 1,Tiam-1)基因在鼻咽癌細胞株中的功能研究目前少有文獻報道。本研究采用免疫細胞化學、RT-PCR等方法，分別檢測不同轉移特性的人鼻咽癌細胞株中Tiam-1表達，分析Tiam-1基因與人鼻咽癌細胞株轉移特性的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇高成瘤高轉移特性鼻咽癌細胞株5-8F、成瘤具有一定轉移特性鼻咽癌細胞株CNE2 、C666-1以及成瘤無轉移特性鼻咽癌細胞株6-10B(其中5-8F、CNE2、6-10B由中山醫科大學腫瘤研究所建系、C666-1由香港中文大學建系)置南方醫院腫瘤研究所細胞庫凍存。濃縮型兔抗人Tiam-1多克隆抗體購自Santa Cruz公司；免疫組化SP-9000試劑盒、DAB顯色試劑盒及磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)購自福州邁新生物技術有限公司；TRIzol和RT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司；Tiam-1和GAPDH引物由上海生工生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人鼻咽癌6-10B、C666-1、5-8F 和CNE2細胞均在37℃、5%CO2培養條件下用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基培養，選擇生長狀態良好的細胞用于實驗。

1.2.2 免疫細胞化學方法 實驗前一天胰酶消化6-10B、C666-1、5-8F 和CNE2細胞，調整細胞密度(2×105個/ml)后制作細胞爬片，次日待細胞約30%～50%融合時，棄去培養液，PBS沖洗后，4%多聚甲醛固定15 min，再用10%正常羊血清封閉30 min，不洗，然后加入Tiam-1一抗(1∶200稀釋)，4℃過夜孵育。次日棄去一抗，PBS沖洗后加入酶標二抗(抗兔)，室溫孵育1 h，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木精復染，最后用中性樹脂封固。PBS液取代一抗作為陰性對照。

1.2.3 RT-PCR方法 待細胞長至狀態良好，鋪滿瓶壁后用TRIzol試劑常規提取人鼻咽癌6-10B、C666-1、5-8F 和CNE2細胞總RNA； 1%瓊脂糖凝膠電泳判斷其完整性、分光光度計測定其濃度和純度后，再各取1μg總RNA按照逆轉錄試劑盒操作生成cDNA，然后以此為模板各取1 μl，在94°C 40 s、60°C 30 s、72℃ 45 s條件下進行PCR反應，共30個循環。Tiam1引物為5′-AAGACGTACTCAGGCCATGTCC-3′，5′-GACCCAAATGTCGCAGTCAG-3′，擴增片段為253 bp，看家基因GAPDH為內對照，引物為5′- AATCCCATCACCATCTTCCA -3′，5′- CCTGCTTCACCACCT TCTTG-3′ -3′，擴增產物為580 bp。

1.3 統計學分析

所有實驗數據均采用SAS 6.12軟件進行分析。完全隨機設計多樣本均數比較用方差分析，等級資料的相關關系用Spearman相關系數表示。

2 結果

2.1 不同轉移特性鼻咽癌細胞株中Tiam-1蛋白表達

免疫細胞化學檢測顯示，Tiam-1蛋白在全部5-8F細胞胞質中呈棕黃、棕褐色強表達，在大部分6-10B細胞中呈微弱的淡黃色弱表達或不表達，在C666-1、CNE2細胞質中呈黃色中度表達。

2.2 不同轉移特性人鼻咽癌細胞株中Tiam-1 mRNA的表達

所提取的4種人鼻咽癌細胞株總RNA，用紫外分光光度計測定RNA濃度和純度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，結果表明其OD值(A260/280)均在1.8～2.0之間，電泳檢測有3條清晰的rRNA帶：28 s、18 s和5 s，說明RNA無降解，質量較好(圖1)。

應用RT-PCR檢測4種人鼻咽癌細胞株中Tiam-1 mRNA的表達，采用1-D ADVANCED軟件進行區帶的灰度分析，分別以Tiam-1和 GAPDH擴增帶的密度比值表示各腫瘤細胞株的表達水平。結果表明Tiam-1基因在鼻咽癌高轉移細胞株5-8F中的密度比值為0.817±0.040，無轉移特性的細胞株6-10B中為0.103±0.015，C666-1、CNE2細胞中分別是0.383±0.025、0.497±0.047，差異有統計學意義(F=220.770，P<0.05)，且與轉移特性的高低呈正相關關系(γs =0.852，P<0.05，圖2，表1)。

圖1 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性

圖2 RT-PCR方法檢測不同鼻咽癌細胞株中Tiam-1表達

表1 4種鼻咽癌細胞中Tiam-1基因的表達分析

△為采用SNK法，各種細胞間比較P均<0.05；γs為Spearman等級相關系數

3 討論

Tiam-1基因是1種原癌基因，最初是從小鼠T淋巴瘤細胞高侵襲變異株中分離鑒定得到[3]。許多研究表明Tiam-1基因在多種惡性腫瘤組織中均有表達，且其表達水平與惡性腫瘤的侵襲轉移能力密切相關[4～9]。Habets等[10]通過對不同淋巴瘤、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌等細胞株中Tiam-1表達進行的研究，發現Tiam-1基因表達與腫瘤細胞的侵襲轉移特性有一定的聯系。在鼻咽癌研究方面羅元等[11]曾對41例不同臨床分期人鼻咽癌組織以及20例鼻咽粘膜慢性炎癥組織中Tiam-1的表達進行分析，認為鼻咽癌組織中Tiam-1蛋白表達要高于鼻咽粘膜慢性炎癥組織，并與鼻咽癌臨床分期等具有相關性。在前期的研究中，我們曾利用脂質體轉染法將含Tiam-1 cDNA的質粒分別轉染CNE1和C666-1人鼻咽癌細胞，發現Tiam-1 蛋白過表達明顯增強了轉染細胞的黏粘附、遷移及侵襲能力[12]。因此，有關Tiam-1基因在不同人鼻咽癌轉移細胞株中的表達及與細胞侵襲轉移特性的關系值得研究。研究表明，同一惡性腫瘤組織可由不同的腫瘤細胞亞系組成，它們大多具有不同的生物學行為，表現出不同的臨床和(或)病理學特性[13，14]。5-8F細胞株具有高成瘤、高轉移特性[15]；6-10B細胞株具有成瘤、不轉移特性[15]；CNE2、C666-1細胞株具有成瘤和一定的轉移特性[16～18]。

本實驗通過檢測不同轉移潛能的鼻咽癌細胞株中Tiam-1的表達，發現Tiam-1在具有高轉移特性的5-8F鼻咽癌細胞中呈高表達，在沒有轉移特性的6-10B細胞中Tiam-1呈弱表達，而在具有一定轉移能力的C666-1、CNE2細胞中Tiam-1呈中度表達，說明Tiam-1表達水平與鼻咽癌細胞侵襲轉移能力呈正相關關系，與Bourguignon等[19]在乳腺癌、劉莉等[20]在結直腸癌、Engers等[21]在前列腺癌細胞系中研究所得出的結論一致，進一步驗證了我們前期的研究結果[12]。

因此，Tiam-1可以作為判斷鼻咽癌侵襲轉移能力大小的1個參考指標。

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