結直腸癌術后放化療聯合 DC-CIK的療效分析

應敏剛 魏植強 楊建偉 陳路川 鄭秋紅

我院從 2000年 12月至今在結直腸癌根治術后放化療的基礎上,加以熱休克蛋白負載的樹突細胞-細胞因子誘導的殺傷細胞(DC-CIK)療法,明顯降低了復發率,提高了遠期生存率,現總結報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

所選病例為 2000年 12月至 2006年 10月的住院患者共 102例,均經病理學、組織學、細胞學等檢查確診為結直腸癌,均行結直腸癌根治術,術后病理檢查證實為 R0切除。102例患者均為 AJCC(1997)TMN分期的Ⅰ ～Ⅲ期患者,對 I期患者,術后不行放化療。Ⅱ～Ⅲ期患者術后輔助化療。DC-CIK治療組 51例,男性 31例,女性 20例,年齡 28～86歲,中位年齡 59歲,Ⅰ期 6例,ⅡA期 3例,Ⅱ B期 12例,Ⅲ期 30例,術后輔助化療采用 FOLFOX方案 33例,采用 XELOX方案7例,采用 CF+5-Fu方案 3例,采用希羅達方案 2例。接受術后輔助放療 7例。對照組 51例,男性 25例,女性 26例,年齡 20～78歲,中位年齡 54歲,其中Ⅰ期 6例,ⅡA期 3例,Ⅱ B期 12例,Ⅲ期 30例,術后采用FOLFOX方案化療 35例,采用 XELOX方案 3例,采用CF+5-Fu方案 5例,采用希羅達方案 2例,接受術后輔助放療 9例。兩組患者卡氏評分均≥80分,肝、腎功能正常,外周血 WBC≥4.0×109/L,PLT≥100×109/L,H b≥80 g/L,無嚴重的內科疾病。

1.2 主要試劑

Ficoll淋巴分離液(北京軍事醫學科學院 );rh IL-4(英國 Pepro Tech公司);TNF-α(上海賽達生物藥業有限公司);CD3McAb(武漢生物制品研究所);IFN-r(上海克隆公司);rh IL-2(北京瑞德合通藥業有限公司 );GM-CSF(北京聯合藥業有限公司 );RPMI1640、無血清培養基 AIM-V(美國 Gibco公司)。

1.3 HSP70多肽復合物的制備

來源于患者自身腫瘤組織或腫瘤細胞系經玻璃勻漿或超聲波粉碎后,21 000 g/min,離心 60 min,取上清,參照文獻[1]方法,分離純化 HSP70多肽復合物作為腫瘤抗原,用于負載 DC。

1.4 方法

參照文獻[2,3]方法新鮮分離的患者抗凝外周全血50ml,經淋巴分離液梯度離心,取界面層單個核細胞,用 RPMI1640培養液懸浮細胞,離心洗滌細胞 3次后,收集非貼壁細胞,調整細胞密度約為 1×106個/ml,加入 γ-干擾素 1 000 U/ml,24 h后加入 rhIL-2 300U/ml,CD3McAb 70 ng/ml,IL-110U/ml,每 3天換液 1次,同時補加 rhIL-2 100 U/ml。在上述獲得的貼壁細胞中加入含 GM-CSF 1 000U/m l和 rh IL-41 000U/ml的 AIMV培養基,每 3天換液 1次。第 3天將按 5 ng/ml將HSP70多肽復合物加入 DC培養液內,第 5天加入TNF-α1 000 U/ml,第 7天將負載后的 DC按 1∶5的比例加入 CIK培養液中,共培養 5～7天。培養 10天后制成細胞懸液用輸血器回輸,隔天回輸 1次,將 DC、CIK 2種細胞體外混合后全身輸注。劑量:DC-CIK回輸 100m l/瓶,細胞數≥108個/m l,連續 8次為 1個療程。治療組患者最少行 1個療程的 DC-CIK治療,最多行 6個療程的 DC-CIK治療,平均行 4個療程的DCCIK治療,給藥時間一般在術后或化療結束后 15天開始。

1.5 化療及放療方案

所有Ⅱ～Ⅲ期患者行術后輔助化療,采用 FOLFOX、XELOX、CF+5Fu或希羅達方案化療 4～10個周期。術后對Ⅱ～Ⅲ期部分直腸癌患者輔助放療,術后4～6個周開始放療,照射劑量為每周第 1～5天,每天2 Gy,共 5周,總照射劑量為 50Gy。結腸癌患者未輔助放療。

1.6 療效評價

以復發時間和生存期作為觀察指標,觀察時間為患者手術時間到 2009年 10月 1日。

1.7 統計學方法

采用 SPSS15.0軟件包進行生存率、無病生存率計算。應用 Kaplan-Meier生存曲線和 Logrank test檢驗比較兩組生存率及無病生存率。率檢驗采用 χ2檢驗,以 P＜0.05表示統計學差異顯著。

2 結果

2.1 DC-CIK治療組與對照組臨床資料對比結果

兩組從性別、年齡、病理分期、AJCC(1997)中臨床分期、術后輔助化療方案、腫瘤部位和是否接受術后輔助放療等方面進行比較,經卡方檢驗,結果顯示兩組資料無統計學差異,具有可比性(P＞0.05)(表 1)。

表1 兩組患者的臨床資料比較

2.2 生存率

全部病例隨訪至 2009年 10月,隨訪時間為 13～62個月,無失訪,隨訪率為 100.0%。DC-CIK治療組1、2、3年生存率分別為 100.0%、92.2%、88.2%,對照組 1、2、3年生存率分別為 100.0%、86.3%和 68.6%。DC-CIK治療組和對照組中位生存期(mOS)分別為 63個月(95%CI,55-72)、52個月(95%CI,42-62)。 Kaplan-Meier生存曲線和 Logrank test檢驗結果表明,治療組生存期明顯長于對照組(P＜0.05),見圖 1。

圖1 兩組總生存率比較

2.3 無病生存率分析

全部病例隨訪至 2009年 10月,隨訪時間為 1～62個月,無失訪,隨訪率為 100.0%。DC-CIK治療組 1、2、3年無病生存率(DFS)分別為 80.4%、54.9%、43.1%,對照組 1、2、3年無病生存率(DFS)分別為54.9%、33.3%和 27.5%。治療組和對照組中位無病生存時間(mDFS)分別為 34個月(95%CI,28-40)、25個月 (95%CI,19-31)。Kap lan-Meier生存曲線和Logrank test檢驗結果表明治療組無病生存率明顯高于對照組(P＜0.05),見圖 2。

圖2 兩組無病生存率比較

3 討論

DC-CIK細胞具有增殖快、殺傷活性強等優點,在結直腸癌的治療中具有廣闊應用前景。細胞因子誘導的殺傷細胞 CIK細胞(cytokine-induced killer cells)是1種新型免疫活性細胞,兼有 T淋巴細胞強大的抗腫瘤活性和自然殺傷(natural killer cell,NK)細胞的非主要組織相關性復合物限制性殺瘤的特點,殺傷活性可達 84.7%。樹突細胞(dendritic cell,DC)是目前發現的功能最強的抗原提呈細胞,可有效激發 T細胞應答,有效抵制腫瘤細胞的免疫逃逸機制。但腫瘤抗原肽的分子量均較小,難以直接被 DC所攝取;即使被DC攝取,亦不能有效的促進 DC成熟并表達各種黏附分子,缺乏激活 T細胞的第二信號,難以形成有效的免疫應答[4]。HSP的中文全稱是 “熱休克蛋白”,可與小分子腫瘤抗原肽結合,增強其免疫原性。腫瘤細胞中 HSPs結合有大量腫瘤細胞特異性抗原,因其攜帶幾乎所有腫瘤抗原,故從腫瘤細胞中獲取 HSP70多肽復合物,既可得到該腫瘤細胞高效、強免疫原性的腫瘤抗原,同時,由于 HSPs為高度保守蛋白質,同種內不具多態性,可實現對同一腫瘤內的所有瘤細胞特異殺傷,克服了腫瘤免疫治療中難解決的抗原多變性及細胞異質性的問題。DC與經純化的腫瘤 HSP70多肽復合物結合負載后,可活化機體特異性免疫和非特異性免疫反應,誘導機體產生長壽(long-lasting)的抗腫瘤免疫效應。張嵩等[5]以白血病細胞系 NB4建立裸鼠模型,結果發現在培養的 15 d,DC-CIK細胞較 CIK細胞增殖率明顯提高,并可明顯抑制腫瘤的成瘤率,予BAUl/c裸鼠經尾靜脈注射 LoVo結腸癌細胞建立轉移性肺癌模型.并以 DC-CIK細胞進行免疫治療,結果發現 DC-CIK細胞較 CIK細胞有更強的殺瘤活性.可有效抑制血源性腫瘤轉移,延長荷瘤鼠的生存時間。張京雨等[6]報道化療聯合 CIK細胞回輸的結直腸癌患者 CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、NK均顯著高于化療前組,且 CD8+顯著低于對照組,說明化療后及時應用CIK細胞回輸可顯著改善結直腸癌的免疫功能,有助于提高機體的抗腫瘤免疫效應。

本研究采用了 HPS70負載的 DC-CIK,明顯提高了腫瘤特異性細胞毒性 T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL),誘導高效的抗腫瘤免疫效應,結果顯示DC-CIK治療組 3年生存率及 3年無病生存率明顯高于對照組,因此結直腸根治術后放化療聯合應用HPS70負載的 DC-CIK是安全有效的,結直腸癌根治術后放化療聯合 DC-CIK細胞療法能明顯減低復發率,并很有可能對提高結直腸癌患者的遠期生存率有幫助。

[1] 應敏剛,劉 勝,龔福生,等.快速蛋白液相色譜系統分離與純化小鼠結腸癌細胞熱休克蛋白 70〔J〕.中華腫瘤防治雜志,2007,14(18):1386.

[2] 鄭秋紅,鄭天榮,謝云青,等.樹突狀細胞對自體 CIK細胞體外殺傷肺腺癌細胞影響的研究〔J〕.中華腫瘤防治雜志,2005,12(16):1237.

[3] 鄭秋紅,鄭天榮,盧 林,等.人外周血樹突細胞的分離與提純〔J〕.福建醫科大學學報,2000,34(2):115.

[4] Frank O,Nestle,Jacques B.Dendritic cells:on themove from bench to bedside〔J〕.Nature Medicine,2001,7:761.

[5] 張 嵩,張尚權,白春學.樹突狀細胞與同源細胞因子誘導的殺傷細胞共培養細胞在腫瘤免疫治療中的應用〔J〕.中華結核和呼吸雜志,2004,27(5):315.

[6] 張京雨,張曉明.CIK細胞過繼性免疫治療對結直腸癌化療患者免疫指標的影響 〔J〕.腫瘤學基礎與臨床,2009,22(1):51.