let-7a在胃黏膜、慢性萎縮性胃炎、胃癌組織中的表達及其對人胃癌細胞凋亡的影響

朱益民,劉志明,歷成杰,白衛(wèi)兵

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院胃腸腺體外科,南寧 530021)

let-7a在胃黏膜、慢性萎縮性胃炎、胃癌組織中的表達及其對人胃癌細胞凋亡的影響

朱益民#,劉志明△,歷成杰,白衛(wèi)兵

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院胃腸腺體外科,南寧 530021)

目的研究let-7a在胃黏膜、慢性萎縮性胃炎、胃癌組織中的表達及l(fā)et-7a在體外實驗中對胃癌細胞凋亡的影響。方法原位雜交法檢測組織芯片上11例正常胃黏膜、17例慢性萎縮性胃炎、52例胃癌組織中l(wèi)et-7a的表達,分析三者陽性率及表達強度差異性。并將let-7a用重組慢病毒轉導入人胃癌SGC-7901細胞,采用流式細胞儀檢測let-7a對胃癌細胞凋亡的影響。結果(1)let-7a在正常胃黏膜、慢性萎縮性胃炎、胃癌組織中的陽性表達率分別為90.9%、88.2%、82.7%,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),而表達強度隨著胃黏膜癌變的演進逐漸減弱,采用有序分組資料的線性趨勢檢驗分析(P＜0.05)。(2)流式細胞儀對凋亡分析顯示,let-7a對SGC-7901的凋亡有明顯的促進作用(P＜0.01)。結論let-7a表達的減弱與胃黏膜癌變演進過程相關;let-7a能夠促進SGC-7901細胞的凋亡,提示let-7a能有效抑制胃癌細胞。

miRNA;胃癌;組織微陣列;原位雜交;凋亡

微小RNA(micro RNA,miRNA)普遍存在于多細胞生物中,約占整個基因組基因總數2%左右[1]。miRNA是一種內源性的、小的、非編碼RNA分子,長約22個核苷酸,調控轉錄后的翻譯,并已被證實參與和調控了包括時序發(fā)育、細胞凋亡、脂肪代謝、神經元發(fā)育、細胞分化、激素分泌等在內的多種生理過程。2001年才認識到miRNA兼有腫瘤抑制基因和癌基因的功能,在腫瘤的診斷和預后中miRNA可以補充其他基因組和蛋白組的生物標記[2-3]。lethal-7(let-7)是較早被發(fā)現的有腫瘤抑制作用的miRNA,let-7是其家族中的一員。慢性萎縮性胃炎是公認的癌前病變,本研究利用組織微陣列結合原位雜交技術檢測let-7a在正常胃黏膜、慢性萎縮性胃炎及胃癌組織中的表達,分析let-7a在3種組織中陽性表達率的差異性及其表達強度與正常胃黏膜→慢性萎縮性胃炎→胃癌這一病變演進過程的關系。本科還從正常組織中克隆let-7a全長基因,并將其連接到了慢病毒載體(Lentiviral vector),利用重組慢病毒將let-7a轉導入胃癌SGC-7901細胞,研究轉基因前后SGC-7901細胞凋亡率的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織、細胞及質粒來源 所使用的組織芯片是陜西超英生物科技有限公司產品,芯片代碼為CC01-01-08,含80個組織點,排列成8行10列,點樣直徑1.5 mm,其中正常胃黏膜11個點、慢性萎縮性胃炎(伴非典型性增生)17個點、胃癌52個點(腺癌42例、鱗癌8例、印戒細胞癌2例)。同時收集各種組織的一般臨床資料。正常胃黏膜標本中男9例、女2例,平均年齡58歲;慢性萎縮胃炎標本中男12例、女5例,平均年齡58.5歲;胃癌標本中男41例、女11例,平均年齡57.8歲。人胚胎腎上皮細胞293 T、人胃癌細胞系SGC-7901均購自中國科學院上海細胞庫。質粒 Pwpxl-MOD2、pRsv-REV、pMDlgpRRE、pMD2G由上海交通大學劉天津博士惠贈;let-7a表達質粒Pwpxl-MOD2-let-7a由本實驗室構建。

1.1.2 試劑盒、酶、試劑及引物來源 let-7a探針購自丹麥Exoqin公司,抗地高辛-辣根過氧化物酶復合物檢測試劑盒(Anti-Digoxigenin-POD,Fab fi-agrnents)購于Roche公司;let-7a特異性寡核苷酸引物由上海生物工程技術公司設計合成,上游引物序列 AGGATCCAAAGGTGGTGGTAAGAGGGTGAT,下游引物序列 AGTCGACATAAGACAAGAAGCAAAAGGT TT。胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)液購于美國Gibco公司。總RNA提取試劑T rizol購于Invitrogen公司。逆轉錄試劑盒購于Promega公司。限制性內切酶、Real-Time PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。T4連接酶購自TOYOBO公司,DNA抽提試劑盒、凝膠回收試劑盒購自Axygen公司,AnnexinV/PI試劑盒購自南京凱基生物公司。

1.2 方法

1.2.1 原位雜交檢測let-7a在組織微陣列中的表達 實驗方法:4 μ m厚的組織微陣列切片脫蠟,PBS/DEPC水洗后,經 10 mg/L胃蛋白酶K 37℃消化28 min,過梯度乙醇(70%～80%-95%～100%)室溫涼干,0.2 mol/L HCI于37℃反應20～30 min增加組織通透性,4%多聚甲醛(0.1 mol/L PBS溶解)室溫條件下固定10 min,0.1 mol/L TEA緩沖液Ⅰ[0.1 mol/L三乙醇胺與乙酸酐混合液,濃度0.25%(體積比)]和T EA緩沖液Ⅱ[0.1 mol/L三乙醇胺與乙酸酐混合液,濃度0.5%(體積比)]雜交前處理以增加組織陽性雜交的強度。雜交:探針Has-let-7a用雜交液稀釋至20 nmol,滴加于組織芯片上,39～45℃水浴鍋內雜交18 h。雜交后用TBS溶液沖洗3次,每次10 min,封閉液封閉25 min(封閉非特異的抗體結合位點)。雜交后采用 Anti-Digoxigenin-POD檢測地高辛探針與 miRNA結合復合物,TSA放大系統(tǒng)增強原位雜交反應的陽性信號,NBT/BCIP顯色,顯微鏡下控制顯色反應,加核快紅復染3 min,中性樹膠封片。

陽性對照和陰性對照:看家基因β-actin的寡核苷酸探針作為每次雜交的陽性對照,不加探針的預雜交液作每次實驗陰性對照。結果判斷:光學顯微鏡下對let-7a在組織微陣列切片中每一組織點的表達行綜合觀察判斷。(1)根據陽性染色強度判斷:細胞無染色為0分;細胞呈淺藍色記1分;細胞染成藍色并無背景染色,為中等陽性,記2分;細胞呈紫色,無背景著色,為強陽性,記3分。(2)根據陽性細胞數計分:無陽性細胞計0分;陽性細胞數小于或等于30%計1分;30%～70%計2分;陽性細胞數70%以上計3分。取兩種計分結果的乘積,0分為陰性,1、2、3、4、6、9分為陽性,其中 1、2 分計作 ±,3、4 分計作+,6分計作++,9分計作+++。

1.2.2 重組慢病毒介導的基因轉移 用磷酸鈣沉淀法將Pwpxl-MOD2-let-7a、pRsv-REV、pM Dlg-pRRE、pMD2G 共轉染包裝細胞293T,獲得攜帶目的基因 let-7a和綠色熒光蛋白(GFP)基因的重組病毒,同時共轉染 Pwpxl-MOD2、pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G進另一組293T作為陰性對照。按文獻[7]方法獲取重組慢病毒后用它們分別感染胃癌SGC-7901細胞系,分別獲得過表達 let-7a的 SGC-7901-Pwpxl-MOD2-let-7a細胞株(實驗組)和轉染了空載體(僅表達GFP)的SGC-7901-Pwpxl-MOD2細胞株(陰性對照組),親代SGC-7901細胞作為本實驗的空白對照組。

1.2.3 胃癌細胞株let-7a基因表達檢測

1.2.3.1 重組慢病毒介導基因轉導效率的檢測 重組病毒感染48 h后,將培養(yǎng)皿放在熒光顯微鏡下,觀察有綠色熒光的細胞數,判斷感染的效率。同時可用流式細胞儀(FCM)檢測GFP陽性細胞百分數,驗證慢病毒感染效率(轉基因效率)。

1.2.3.2 采用實時定量PCR(qReal time-PCR)檢測3組細胞中目的基因的表達 重組病毒感染細胞72 h后收集靶細胞,按TrIzol Reagent說明書的步驟,抽提各組細胞的 Total RNA,并利用 ReverTra Ace-αFirst Strand cDNA Synthesis Kit,經RT-PCR生成相應的cDNA,逆轉錄引物:oligodT和let-7aPRT:GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA ACT A,經 RT-PCR生成相應的cDNA,以各組cDNA作為模板,利用兩步法進行qReal time-PCR(qReal time-PCR儀為:Eppendorf RealPlex4,Eppendorf Co,LTD)。采用20μ L反應體系,SYBR Green熒光染料10 μ L,10 μ mol/L 的引物1 μ L,cDNA 5 μ L,H2O 4μ L 。 反應條件:退火溫度為54℃,延伸溫度為45℃,共40個循環(huán),讀取Ct(Cycle threshold)值。據相對定量法(mRNA的相對變化量公式Ratio=2-△△Ct)計算目標片段的擴增比例。各樣本重復3次,以18S RNA作為內參。空白對照組以同樣的方法作檢測。

1.3 let-7a對胃癌細胞凋亡影響的體外實驗 一式三份4×105個對數生長期的實驗組、陰性對照組、空白對照組細胞分別培養(yǎng)在6孔的培養(yǎng)平板中,37℃孵育過夜,按AnnexinV/PI試劑盒說明進行凋亡檢測,AnnexinV(+)、PI(-)判斷為早期凋亡細胞;AnnexinV(+)、PI(+)為晚期凋亡細胞和壞死細胞;AnnexinV(-)、PI(-)為成活細胞;AnnexinV(-)、PI(+)為損傷細胞。實驗重復3次。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS11.5軟件中的χ2檢驗分析let-7a在正常胃黏膜、慢性萎縮性胃炎、胃癌組織中陽性表達率的差異性;采用有序分組資料的線性趨勢檢驗(Chi-Square and Correlations Test)分析 let-7a在3種組織中的表達強度與正常胃黏膜→慢性萎縮性胃炎→胃癌這一病變演進過程的關系,計量資料用±s表示,采用SPSS10.0軟件作統(tǒng)計學處理,樣本均數的比較采用單因素方差分析,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 let-7a在正常胃黏膜、慢性萎縮性胃炎、胃癌組織中的原位表達 在正常胃組織黏膜上皮細胞漿、核及腺體細胞漿、核有陽性染色。在炎性組織及增生組織中,增生的黏膜上皮細胞核、腺體細胞核、漿均有著色,部分淋巴細胞亦有著色。在胃癌組織中以癌細胞胞漿著色為主,部分癌細胞核亦有著色。陰性對照:背景干凈,無藍紫色著色;陽性對照:非特異性著色少,背景清晰。let-7a在正常胃黏膜、慢性萎縮性胃炎、胃癌組織中的原位表達的結果見表1、插頁Ⅰ圖1。let-7a在正常胃黏膜、慢性萎縮性胃炎、胃癌組織原位表達中的陽性率分別為90.9%、88.2%、82.7%。采用χ2檢驗分析比較發(fā)現 let-7a在3種組織中的陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

2.2 let-7a表達強度與胃黏膜癌病變演進的關系 let-7a在正常胃黏膜、慢性萎縮性胃炎、胃癌組織中的原位表達強度經采用有序分組資料的線性趨勢檢驗,P=0.008。let-7a在胃黏膜、慢性萎縮性胃炎、胃癌組織中的表達強度呈線性關系,即隨著胃黏膜癌變的演進,let-7a在胃黏膜、慢性萎縮性胃炎、胃癌組織中的表達強度逐漸消減。

2.3 基因轉導效率的檢測結果 重組慢病毒感染靶細胞48 h后,放在熒光顯微鏡下幾乎100%細胞表達GFP,FCM檢測靶細胞GFP表達,其陽性率達98%以上。

2.4 采用qReal time-PCR檢測3組細胞中l(wèi)et-7a的表達結果qReal time-PCR檢測各樣本:將實驗組、空載體組、空白對照組細胞采用Real Time PCR檢測后,讀取各組的Ct值。△△Ct=〔Ct(實驗組 let-7a)-Ct(實驗組18S RNA)〕-〔Ct(空白對照組 let-7a)-Ct(空白對照組 18S RNA)〕,然后用2-△△Ct計算,表示實驗組let-7a基因的表達與空白對照組的相對變化倍數,同法計算空載體組let-7a基因的表達與空白對照組的相對變化倍數。重組慢病毒介導的Pwpxl-MOD2-let-7a轉導入胃癌SGC-7901細胞后,let-7a的表達量明顯增高;而陰性對照組(重組慢病毒介導的Pwpxl-MOD2轉導入胃癌SGC-7901細胞)和親代的胃癌SGC-7901細胞檢測到的 let-7a的表達水平相對較低,見圖2。

圖2 Real time-PCR檢測SGC-7901轉染let-7a后表達量的變化

表1 let-7a在胃黏膜癌病變演進組織芯片上原位雜交的表達

2.5 let-7a對SGC-7901細胞凋亡的影響 FCM檢測顯示let-7a對SGC-7901細胞凋亡有明顯的促進作用,轉導 let-7a的實驗組凋亡率為(12.0±3.1)%,與空白對照組(1.9±1.0)%相比差異有統(tǒng)計學意義(P=0.002),而陰性對照組(2.5±0.7)%與空白對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P=1.0),見圖 3。

圖3 let-7a對SGC-7901細胞凋亡的影響

3 討 論

let-7a是1993年被發(fā)現的第2個 miRNA,成熟 let-7a其長22個核苷酸高度保守,提示這一片段是其功能的核心。Johnson等[4]研究顯示let-7在肺癌中表達低于正常肺組織。Takamizawa等[5]報道人類肺癌中 let-7經常減少,并且與術后生存期顯著相關。通常石蠟塊包埋的組織中會丟失部分蛋白/RNA生物標記,而miRNA卻因其分子結構短小而不易被RNA酶或機械分解[6]。miRNA的序列短而雜交親和力弱、特異性差,采用鎖定核苷酸技術(locked nucleic acid,LNA)可以克服此缺陷[7]。本實驗采用組織芯片加鎖定核苷酸的探針作原位雜交收到了滿意的效果。本實驗中l(wèi)et-7a在正常胃黏膜、慢性萎縮性胃炎和胃癌組織中的陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義,有可能是因本實驗所采用的組織芯片所包含的正常胃黏膜樣本量太小而影響統(tǒng)計的結果。分析比較let-7a在正常胃黏膜、慢性萎縮性胃炎、胃癌組織中的表達強度,本研究結果顯示,隨著胃黏膜癌變的演進,其表達強度逐漸減弱,即 let-7a在正常胃黏膜、慢性萎縮性胃炎、胃癌組織中的表達逐漸遞減。提示let-7a在正常胃黏膜、慢性萎縮性胃炎、胃癌組織中的表達變化是一個量變過程,而非質變。由于胃癌組織塊包含腫瘤細胞和不少的非腫瘤細胞,實時反轉錄聚合酶連鎖反應(realtime qRT-PCR)檢測雖有定量優(yōu)勢,其結果未能完全反映出胃癌細胞中的 let-7a表達情況,原位雜交檢測胃癌中l(wèi)et-7a,可以更直觀地顯示出腫瘤細胞中的表達情況,是了解miRNA時序性和組織特異性表達更有效的方法。

在本研究中,重組病毒載體基因轉移方法具有極高的轉染效果,經2個循環(huán)的感染,幾乎可使100%的靶細胞獲得目的基因,通過熒光顯微鏡直接觀察有否GFP表達從而間接知道靶細胞是否被轉染和表達let-7a。本體外研究顯示,let-7a能夠顯著增加SGC-7901細胞的凋亡率。細胞凋亡是受基因控制的,是細胞主動參與其自身有序的生理死亡過程,誘導腫瘤細胞凋亡是抗腫瘤的主要途徑[8]。提示let-7a有抑制胃癌細胞SGC-7901生長的抗腫瘤作用。

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Study of in situ expression of let-7a in the gastric mucosa cancerization tissue array and the effect of let-7a on apoptosis of human gastric carcinoma cell line

Z HU Yi-min#,LIU Zhi-ming△,LI Cheng-jie,etal.
(Department of General Surgery,The First A f filiated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,China)

ObjectiveTo investigate the expression of let-7a micro RNA in the human gastric mucosa cancerization progression tissue array,and study the effects of the let-7a on apoptosis in human gastric carcinoma cell lines.MethodsSitu hybridization was used to detect the expression of let-7a in gastric mucosa cancerization progression tissue microarray containing 11 cases of normal gastric tissue,17 cases of chronic atrophic gastritis(atypical hyperplasia)and 52 cases of gastric carcinoma.The let-7a was transferred to the human gastric carcinoma cell lines SGC-7901 by recombinant lentiviruses which carrying let-7a and cells apoptosis were analysised for the infected cells by flow cytometry(FCM).Results(1)The positive cases of let-7a expression in normal gastric tissue,chronic atrophic gastritis and gastric carcinoma were 10,15,and 43 respectively.There was no significant difference of positive rate among the three groups.However,the degrees of let-7a expression in the groups were closely related to the progression of gastric mucosa cancerization.(2)Flow cytometry based cell apoptosis assays showed that overexpression of let-7a could increase apoptosis in SGC-7901 cells(P＜0.01).ConclusionThe decrease of let-7a is related to progression of gastric mucosa cancerization.let-7a can promote apopotosis in SGC-7901 cells.It suggests that let-7a can effectively inhibit gastric carcinoma.

miRNA;gastric carcinoma;tissue microaray;situ hybridization;apoptosis

R735.2;R730.54

A

1671-8348(2010)08-0921-03

#廣西醫(yī)科大學研究生學院在讀博士生。△< class="emphasis_bold">通訊作者,

,電話:13152663170;E-mail:zym330422@163.com。

2009-11-07

2009-12-03)

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