高效液相色譜法測定人血清中大黃素的含量*

曹晶萍, 魏曉晴，趙 瑩, 崔 穎，高 穎,2

(1.遼寧省醫學細胞分子生物學重點實驗室，遼寧 大連 116044； 2.大連醫科大學 生物化學與分子生物學教研室， 遼寧 大連 116044)

目前，已有很多文獻報道HPLC法測定各種藥品中大黃素的含量，但少見人體血清中大黃素濃度的測定方法。為分析大黃素在人體血清中濃度及藥動學規律，本文參考有關文獻[1-5]，建立了高效液相色譜法測定人體血清中大黃素的分析方法，報告如下。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

Waters1525型高效液相色譜儀，Wsters2487紫外檢測器，Breeze色譜管理系統，UNIVERSAL 30RF高速冷凍離心機，XH-C型旋渦混合器。大黃素標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號：0756-200211)，甲醇為國產色譜純，磷酸為國產分析純，超純水經微孔濾膜濾過后使用。

1.2 方 法

1.2.1 色譜條件：色譜柱：Nova-Pak C18 (3.9 mm×150 mm，4 μm)。流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液(80∶20)，流動相均以0.45 μm濾膜過濾，超聲脫氣后使用。流速1.0 mL/min，柱溫37℃。紫外檢測器檢測，檢測波長254 nm。進樣量：20 μL。

1.2.2 標準溶液與標準曲線：準確稱取大黃素標準品適量，用甲醇溶解稀釋配成含大黃素1 mg/mL的標準儲備液，充氮氣后放于-80℃低溫冰箱保存。取大黃素標準溶液(1 mg/mL)用甲醇稀釋成濃度分別為0.1、5、10、15、20 μg/mL的標準系列應用液。

1.2.3 樣品的測定：取8名健康志愿者血清200 μL，置于2.0 mL帶蓋塑料離心管中，加入800 μL乙醚，放至旋渦混合器上震蕩15 min后， 然后以-4 ℃，12000 g離心10 min。 準確吸取上層乙醚提取液400 μL移入另一2.0 mL帶蓋塑料離心管中。通氮氣將提取液揮發干后，立即加入100 μL甲醇并蓋上蓋子，在旋渦混合器上震蕩溶解，使殘留物溶于甲醇，-4℃，12000 g離心10 min，用微量進樣器吸取20 μL上清液進樣分析。

1.2.4 加樣回收率及精密度實驗：用正常人血清適量，準確加入大黃素標準溶液，按照樣品測定方法操作分析，每批樣品同一天內重復測定5次，同批樣品連續測定5 d。將峰面積差值代入回歸方程并計算回收率和精密度

2 結 果

2.1 色譜分離

選用254 nm檢測波長時，大黃素有較大吸收值，并且能與其他峰有效地分離。標準溶液和血清樣本中大黃素的保留時間為4.65 min。見圖1。

圖1 大黃素在血清中的色譜行為A 為標準溶液色譜圖；B 為人體血清中大黃素色譜圖

2.2 標準曲線及檢出限

取標準系列應用液分別進樣測定，以濃度(X)對樣品的峰面積(Y)進行回歸，求得回歸方程：Y=4.36e+004X+3.22e+005，相關系數r=0.9993。以基線噪音3倍峰面積對應的大黃素含量作為最底檢出限20 ng/mL。

2.3 加樣回收率及精密度

平均回收率為99.01%，日內相對標準偏差為2.16%，日間相對標準偏差為3.78%。

2.4 樣品測定結果

取8名健康志愿者含大黃素血清，按照樣品測定方法操作，以外標法計算大黃素的血清藥物濃度分別為2.55、2.16、 2.09、 2.06、 1.98、 1.96、 1.80、 1.51 μg/mL，平均值為2.01 μg/mL。

3 討 論

大黃素(Emodin)，化學名，1'3'8-三羥基-6-甲基蒽醌，分子量為270.23，來源為蓼科植物虎杖的干燥根莖和根， 掌葉大黃的根莖， 橙黃色長針狀結晶。 口服大黃素在腸內易于吸收，2～3 h后血中即達最高濃度，以后慢慢下降，亦有人把它制成注射劑，用于肌肉和靜脈注射。在臨床上，用大黃素純品治療腫癌，主要用于白血病、胃癌等腫瘤，而最常用的則用于抑菌。因此，建立一種簡單、快速、靈敏、穩定的人血清中大黃素的測定方法很有必要。

本實驗分別使用乙醚[1]、正己烷、氯仿[2-5]為提取劑，經過實驗比較發現，用乙醚提取的樣品提取回收率明顯高于其他兩種有機試劑，且考慮到乙醚易揮發且毒性較小，故選乙醚作為提取劑。流動相選擇為甲醇-0.1%磷酸溶液(80∶20)，甲醇與0.1%磷酸溶液的比例對保留時間和分離度有影響，經實驗選擇兩者比例為80∶20可得到較好的分離效果及合適的保留時間。

本實驗研究了國內外各種方法的優點，建立了高效液相色譜法測定人體血清中大黃素的含量，實驗結果證明被測組分大黃素峰形對稱，無拖尾現象，無干擾，精密度也較理想，而且具有快速、靈敏、準確和重復性好等優點，故適用于人體血清中大黃素濃度的測定及藥代動力學、生物利用度研究。

[1] 李蘭芳，張勤增，解麗君，等.通脈活血膠囊中大黃素在大鼠血漿中的濃度及藥代動力學研究[J]. 河北醫藥，2006，28(11)：1020-1022.

[2] 林志強. 高效液相色譜法快速測定養血安神糖漿中大黃素的含量[J].中國實驗方劑學雜志，2006，12(11)：26-27.

[3] 袁華峰. HPLC法測定肝炎合劑中大黃素的含量[J].藥學與臨床研究，2008，16(2)：155-156.

[4] 王曉宏. HPLC法測定護肝寧膠囊中大黃素[J].現代中藥研究與實踐，2008，22(3)：44-45.

[5] 林瑞紅.高效液相色譜法測定降脂寧片中大黃素的含量[J]. 中藥材，2008，31(2)：306-308.