宮頸病變與端粒酶及端粒酶基因*

黃相艷,石 紅

(大連醫科大學 附屬第一醫院 婦產科，遼寧 大連 116011)

宮頸癌是婦產科常見的惡性腫瘤之一，HPV感染雖是其已知的主要致病因素，但由于HPV并不能單獨致瘤，細胞內遺傳性因素的改變可能具有更重要的意義。現代遺傳學和分子生物學的研究均提示在宮頸上皮病變中存在人類染色體端粒酶基因(the human telomerase gene，hTERC)的擴增，鑒于已知端粒酶在腫瘤發生中的重要作用及其與端粒酶基因表達的一致性，人們推測，染色體端粒酶基因的擴增與宮頸病變的發生有密切聯系。本文就相關研究進展進行簡單綜述。

1 染色體異常與宮頸癌變

分子生物學研究已經證實，腫瘤是基因病。各種環境的和遺傳的致癌因素可能以協同或序貫的方式引起細胞內非致死性的DNA損害，這種錯誤的不斷積累導致腫瘤的發生[1]。宮頸癌也是多種遺傳事件不斷積累的結果，只是不同腫瘤具有不同的異常染色體及染色體帶，每種類型腫瘤的染色體改變具有特異性及一致性。子宮頸從不典型病變到浸潤性癌常需要一段時間較長、階段性較強的轉化期，其階段性進程特性更有利于人們從細胞自身遺傳學角度研究其從CIN進展為宮頸癌的機制，為從染色體分子水平研究宮頸病變提供了可能。

針對宮頸癌染色體異常的研究發現，子宮頸癌變與1，3，4，5，6，11，13，17，18和20號染色體異常有關[2-4]。其中比較重要的是1號染色體和3號染色體，它們是主要的非隨機事件。關于3號染色體，國外已有研究[5-7]，3號染色體長臂的擴增可能是浸潤性宮頸癌的重要特點和宮頸癌發生發展過程中的早期事件。國內劉騰飛等[8]在建立子宮頸癌發展演進樹模型的過程中也發現，3號染色體長臂擴增(+3q)在子宮頸癌非隨機染色體事件統計中的發生頻率可高達70.7%，且+3q的出現可能導致+17q的發生，而+17q的發生又將促進+20q的發生，+20q的發生必將增加+5p、+20p出現的概率。從距離樹可以清楚地得出+3q是宮頸癌發生發展過程中較重要的早期事件。國內外這些針對子宮頸癌染色體的研究，均顯示了3號染色體長臂的擴增可能是宮頸癌變發生發展過程中的重要事件和早期事件。這提示，在3號染色體長臂上可能存在與宮頸癌發生發展密切相關的腫瘤基因。此基因放大區域已經被確定為3q24-28。其中，所涉及最重要的基因可能是人類染色體端粒酶基因[5-7](即hTERC基因，位于3q26.13)，這為后續相關研究指明了方向。

2 HPV與端粒酶及端粒酶基因

目前的研究已經表明,高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染是宮頸癌發病的首要因素。據統計80%的婦女一生中都會有過一次HPV感染，但由于人體自身具有免疫力，多數HPV會被清除，說明單純的HPV感染并不能致瘤，仍需要其他因素的參與[4]，這其中細胞內遺傳性因素的改變可能具有更重要的意義。高危型HPV的持續感染，改變了宮頸上皮細胞的內外環境，引起細胞內非致死性的DNA損害，這種錯誤的不斷積累導致宮頸上皮惡性轉化的可能急劇上升，最終導致癌的發生。研究已經證實，HR-HPV在宮頸良性病變中以游離狀態存在為主，癌變過程中，在某些細胞內外因素的觸發作用下，DNA整合到宿主細胞，游離態HR-HPV數量減少，E2表達中斷。當E2表達降低到一定程度時，失去對共同存在的整合形式的HR-HPV的抑制作用，癌基因E6/E7表達增加[9，10]，E6/E7的過表達則增加了整合的HR-HPV的選擇優勢和宿主染色體的不穩定性。在E6/E7的作用機制中，E7引起染色體異常復制，導致宿主染色體不穩定，使宿主細胞癌變，而E6能抑制抑癌基因p53介導的細胞凋亡，并激活端粒酶[11]。亦有研究指出，p53基因被抑制后發揮作用的同時會對端粒酶基因及端粒酶的激活產生協同作用，促進癌癥的發生。這提示HPV的致癌過程也與端粒酶及端粒酶基因密切相關。Snijder[12]等研究認為HPV感染早于端粒酶基因水平上調，是端粒酶活化的原因。Aloysius[13]等也得出了同樣的結果，并且發現HPV的作用十分迅速，在HPV的感染后的第一代細胞中就檢測到端粒酶的活性。Hopman等[14]也通過應用FISH方法檢測CINⅡ/Ⅲ、微浸潤癌和浸潤性宮頸癌的hTERC基因和HPV整合，發現在HPV整合的雙倍體病變中，80%可見hTERC基因增加，且在hTERC基因增加的病例，HPV整合突出，提示了HPV整合與hTERC基因擴增的平行及一致性。結合以往研究，人們推測端粒酶基因及端粒酶的激活可能是HPV致癌機制中的重要環節，繼發于HPV感染的宮頸上皮病變的發生仍需要端粒酶基因擴增的參與作為首要補充，且這種基因的改變先于惡性基因轉變并伴隨著從ASCUS至CINⅢ的進展[15]，是宮頸病變的早期事件。

3 端粒、端粒酶及端粒酶基因

可以看出，在針對宮頸癌的研究中，不管是染色體水平還是HPV致癌的分子水平均有端粒酶或端粒酶基因的指向，說明端粒酶及端粒酶基因與宮頸癌變進程有關，并可能在其中發揮了重要作用。端粒酶的意義是通過端粒的作用來實現的。端粒是真核生物染色體末端的特殊結構。端粒結構對于真核染色體DNA復制過程中保持DNA長度有非常重要的作用，如果沒有端粒，染色體之間就會相互粘連，結構發生變化，并可能以其他方式表現出錯誤的行為，如降解、融合、重組和易位等，而這些錯誤能夠嚴重地威脅染色體的生存和復制，可導致細胞死亡和錯誤復制[16]。由于DNA聚合酶不能完全復制染色體末端，因此，端粒的長度隨著細胞分裂的不斷進行而逐漸縮短，細胞趨向衰亡，被認為是細胞分裂的“生物鐘”[17]。

端粒酶是影響端粒長度的主要因素。它是一種特殊的逆轉錄核糖核蛋白酶，能以其自身的RNA為模板，向端粒末端添加( TTAGGG)n序列，以保持端粒的長度和細胞的生存，從而延長細胞的壽命甚至使其“永生”[18]。已經有大量的研究顯示端粒酶活性的上調與腫瘤的發生有關。端粒酶在惡性腫瘤中的陽性表達率達90%～100%，而正常人體細胞幾乎未檢出端粒酶的活性，現在的觀點認為癌細胞正是由于端粒酶活性增強使染色體端粒維持在一定長度而獲得了永生和無限增殖[19]。

人類端粒酶包括三個主要組成部分，人端粒酶RNA (human telomerase RNA component,hTERC)，人類端粒酶相關蛋白 1(human telomerase associated protein1,hTEP1)，人類端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)。其中hTERC為端粒酶的主體結構，含有編碼端粒DNA的模板區、端粒酶蛋白結合區等。hTERC基因定位于3q26.3，是端粒酶延長端粒的模板，同時在介導端粒酶組裝，活性調節等方面發揮著重要作用[20]。有研究表明，敲除編碼小鼠端粒酶RNA基因，端粒酶活性喪失，說明了hTERC基因在端粒酶活性調控中的必要作用。

4 宮頸病變與hTERC基因

宮頸癌作為惡性腫瘤的一種，同樣適用于由端粒酶基因調節的端粒酶活性上調、端粒維持、細胞永生化而導致惡性病變發生的機制。Olaharski[21]等用FISH方法研究宮頸巴氏涂片中的端粒酶基因表達情況，發現CINⅡ、CINⅢ中，端粒酶基因陽性表達者分別占63%和76%，均與正常組差異有統計學意義，且兩者之間的差異也有統計學意義，指出端粒酶基因的陽性表達率和拷貝數隨宮頸病變的嚴重程度而增加，且在這些病例隨訪1～3年后，在端粒酶基因陽性表達的病例中，可以觀測到CINⅠ/Ⅱ進展到CINⅢ者占40.7%，提示這種基因組的擴增改變是子宮頸癌前病變發展到浸潤癌的重要條件甚至必需因素。Heselmeyer-HK等[15]也發現CINⅡ及CINⅢ的端粒酶基因陽性表達率明顯區別于正常樣本、ASCUS及CINⅠ，其敏感性及特異性均能達到90%，且在從正常進展到CIN3及浸潤癌的婦女中，有33%的病例發現了長臂的擴增。而對于CINⅠ/CINⅡ到CINⅢ的敏感性檢測是100%，對于其退化的敏感性是70%。亦提示了端粒酶基因擴增是子宮頸癌變的早期事件，且是宮頸癌變進展的重要條件，通過對這種基因的檢測可以幫助識別低級別損害進展的危險性并減低細胞學篩查的假陰性率。這些研究均提示端粒酶基因可能成為宮頸病變的一種新的生物學標記和獨立的檢測手段，可用于子宮頸癌的篩查及早期診斷，并能在一定程度上評估個體損害惡變的潛在危險性。

5 關于FISH技術

人們在針對宮頸病變的研究中發現了端粒酶基因在宮頸病變發生發展中的重要作用，提示端粒酶基因可能成為宮頸病變的一種獨立的檢測手段，并能在一定程度上評估個體損害惡變的潛在危險性。通過對攜帶基因擴增細胞的數量的統計分析使這種現象成為一種可應用的識別標志。

這種目標基因的顯影就是通過應用原位雜交技術實現的。目前，應用比較廣泛的原位雜交技術是熒光原位雜交技術(fluorescent in situ hybridization，FISH)。FISH是將細胞原位雜交技術和熒光技術有機結合而形成的新技術，其原理是基于堿基互補的原則，用熒光素標記的已知外源DNA或RNA作探針，與載玻片上的組織切片、細胞涂片、染色體制片等雜交，特異的探針與待測核酸的靶序列專一性結合，通過檢測雜交位點的熒光信號來顯示特定核苷酸序列的存在、數目和定位[22]，并通過對這些項目的評定來探討或診斷疾病。

這一技術的優點是可以在保持細胞形態完整性的條件下，檢測出細胞內特定核酸的序列。與宮頸液基薄層細胞學檢查相比，它直接對機體細胞中最穩定的DNA結構進行檢測，更能從本質上解釋和診斷疾病，且這種方法采取了量化診斷方式，避免了主觀偏差對診斷的影響，受主觀因素影響極小，更客觀可信。在技術上，FISH標本取材簡單，可與細胞學同時取材，不增加患者的負擔；可用于間期細胞,不需要細胞培養，操作相對簡單，穩定性較好，可在早期發現少量病變細胞的遺傳學異常，有利于對疾病的早期診斷和治療，有利于降低子宮頸癌的發病率和死亡率。這為子宮頸癌的篩查及診斷提供了新的策略。

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2010年《大連醫科大學學報》征訂啟事

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