實時熒光定量RT-PCR檢測急性白血病中Bmi-1基因mRNA的表達及意義*

于 琦，孟秀香，袁 宏，王 楠，姜艷梅 ，馬末嬌

(1.大連醫(yī)科大學 檢驗醫(yī)學院，遼寧 大連 116044； 2.泰山醫(yī)學院 醫(yī)學檢驗系，山東 泰安 271016； 3.大連醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院 檢驗科，遼寧 大連 116011； 4.中國人民解放軍第210醫(yī)院,遼寧 大連 116013)

癌基因Bmi-1 (B cell-specific Moloney murine leukemia virus insertion site 1)是轉錄抑制因子Polycomb group(PcG)家族中的一員，在胚胎發(fā)育、細胞增殖和細胞周期的調控中起著極其重要的作用?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)Bmi-1基因在多種腫瘤如白血病、淋巴瘤、乳腺癌、結腸癌和肺癌等腫瘤組織中異常高表達，并參與惡性腫瘤的進展，這可能是腫瘤基因治療的新靶點[1-4]。

實時熒光定量RT-PCR技術是近年來發(fā)展起來的探討基因表達的有效手段。與傳統(tǒng)的mRNA定量方法如Northern blot、競爭PCR、RT-PCR半定量檢測等技術相比，實時熒光定量RT-PCR具有操作簡便、快速高效的特點，而且具有更高的靈敏度和特異性，能夠對mRNA進行準確定量[5]。本研究將定量RT-PCR技術應用于Bmi-1基因表達的檢測，建立了靈敏、快速、可靠的定量檢測Bmi-1 mRNA表達的方法，并用此方法檢測白血病患者及健康人外周血標本中Bmi-1基因的表達，以探討B(tài)mi-1基因在急性白血病細胞中的表達及意義。

1 材料與方法

1.1 標本來源

26例急性髓系白血病初診患者的外周血EDTA抗凝標本來自中國人民解放軍第210醫(yī)院，其中M25例，M39例，M44例，M58例。正常對照為10例健康人EDTA抗凝外周血。

1.2 主要試劑與儀器

Trizol及逆轉錄試劑購自Invitrogen公司，pMD18-T simple 載體購自大連寶生物公司，實時熒光定量RT-PCR試劑購自大連寶生物公司，LightCycler 定量PCR擴增儀及專用毛細管由Roche公司提供，實驗所用的引物均由大連寶生物公司合成。

1.3 引物設計及合成

依據(jù)Genebank收錄的Bmi-1基因與GAPDH基因mRNA全序列，設計特異性引物，兩種基因的上下游引物均跨越內含子，以避免基因組DNA的污染。Bmi-1：上游引物5′-TCATCCTTCTGCTGATGCTG-3′，下游引物5′-GCATCACAGTCATTGCTGCT-3′，擴增片段長度221 bp；GAPDH：上游引物5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC -3′，擴增片段長度226 bp。

1.4 細胞總RNA提取及逆轉錄

Trizol法從人肺腺癌細胞A549細胞、白血病及健康人外周血中提取總RNA，紫外分光光度計檢測RNA的質量及濃度。取總RNA進行逆轉錄反應，步驟按操作說明書進行，逆轉錄的cDNA用于PCR反應。

1.5 Bmi-1及GAPDH定量質粒標準品的構建

取cDNA 2 μL，用Bmi-1及GAPDH 的上下游引物于PCR儀上擴增。擴增條件為94℃預變性2 min,94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s,30個循環(huán)，72℃延伸2 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離，用膠回收試劑盒回收，與pMD18-T simple 載體連接。將連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜。取培養(yǎng)基中生長的菌落，提取質粒初步鑒定，陽性克隆進一步測序分析證實(由大連寶生物公司完成)。將篩選出的陽性菌株擴增，抽提質粒，準確定量后10倍系列稀釋，作為標準品，-20℃保存。

1.6 實時定量方法檢測Bmi-1 mRNA

將含有Bmi-1和GAPDH基因的質粒10倍系列稀釋，分別制備107、106、105、104、103copies/μL的標準品，以上述稀釋物及陰性對照分別做熒光定量PCR。反應體系 (共20 μL)：SYBR Premix Ex Taq (2×) 10 μL，上、下游引物各0.4 μL， DNA模板2.0 μL，dH2O 7.2 μL。反應條件：95℃預變性10 s；95℃ 5 s,60℃ 20 s,45個循環(huán)；擴增完畢后進行融解曲線分析。反應結束后，儀器自動繪制標準曲線及融解曲線。根據(jù)各自標準品建立的標準曲線，由軟件自動計算待測樣本中Bmi-1含量。為消除標本處理、逆轉錄和PCR反應差異,以Bmi-1 mRNA 和內參GAPDH mRNA 含量比值作為評價Bmi-1 mRNA表達水平指標。

1.7 特異性檢測

擴增結束后觀察擴增產(chǎn)物的熔解曲線是否為單峰；另取擴增產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察是否為單一條帶。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 Bmi-1基因與GAPDH基因片段的克隆

普通RT-PCR 擴增 Bmi-1基因及GAPDH基因片段的產(chǎn)物分別為221 bp和226 bp,克隆入pMD18-T simple 載體，經(jīng)測序證實,與基因庫序列一致。

2.2 Bmi-1及GAPDH標準曲線的建立

以10倍系列稀釋質粒標準品為樣本，經(jīng)實時定量擴增后，以Ct值為縱坐標，以不同濃度拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標，建立了Bmi-1及GAPDH的標準曲線(圖1、2)。實時熒光定量檢測系統(tǒng)計算出Bmi-1和GAPDH的標準曲線相關系數(shù)均為-1.00，斜率分別為-4.294和-5.054，最低可檢驗1×103copies/μL。

圖1 GAPDH基因標準曲線

圖2 Bmi-1基因標準曲線

2.3 方法的特異性

熔解曲線分析發(fā)現(xiàn)Bmi-1和GAPDH的PCR產(chǎn)物均呈較為銳利的單一峰 ( 圖3、4) ,Tm分別為80.4℃和84.4℃。熔解曲線中沒有其他雜峰出現(xiàn)，可知在用SYBR GreenⅠ熒光染料進行PCR檢測時，熒光信號全部為PCR擴增產(chǎn)物，沒有其他干擾。

圖3 Bmi-1基因擴增產(chǎn)物融解曲線

圖4 GAPDH基因擴增產(chǎn)物融解曲線

不同模板濃度的定量PCR產(chǎn)物在 2%瓊脂糖凝膠電泳呈單一條帶 (圖5、6) ,靶基因Bmi-1與內參基因GAPDH的PCR產(chǎn)物分別呈位于221 bp和226 bp左右，且無其他雜帶，這進一步驗證了反應的特異性。

圖5 Bmi-1定量PCR產(chǎn)物電泳結果

Lane 1：DL2000；Lane 2：陰性對照；Lane 3～7：107～103拷貝/μL質粒擴增產(chǎn)物

圖6 GAPDH定量PCR產(chǎn)物電泳結果

Lane 1：DL2000；Lane 2：陰性對照；Lane 3～7：107～103拷貝/μL質粒擴增產(chǎn)物

2.4 Bmi-1 mRNA在急性白血病初診患者及健康人外周血中的表達

Bmi-1 mRNA在10例健康人外周血中的相對表達量為0.19±0.08，而在26例初診急性白血病患者外周血表達量為0.56±0.12，與對照組的表達量相比，差異有顯著性意義(P<0.05)。

3 討 論

Bmi-1是1991 年發(fā)現(xiàn)的一種原癌基因，該基因位于人10 p13，含有10個外顯子和10個內含子。人類Bmi-1 cDNA全長3251 bp，其開放閱讀框編碼的蛋白含有326個氨基酸，相對分子質量為44～46 kD。Bmi-1屬于轉錄抑制因子polycomb group家族，通過抑制下游靶點(Ink4a/ARF位點)而促進細胞增殖、參與胚胎發(fā)育及腫瘤的惡性進展。Bmi-1基因決定著白血病干細胞和乳腺癌干細胞等腫瘤干細胞的自我更新能力，可作為基因治療腫瘤的靶點。

本研究選擇SYBR Green I熒光染料進行定量反應。這是一種雙鏈 DNA特異性結合的染料，在與雙鏈DNA結合之后，可以在特定的激發(fā)波長下發(fā)出熒光[6]。SY BR Green Ⅰ的最大優(yōu)點就是實驗設計簡單，成本低廉，通用性好，可用于對多種目的基因進行檢測。

對于實時熒光定量 PCR，最為簡單、準確的定量方法就是標準曲線法[7]，即用一系列已知濃度的標準品制作標準曲線，在同等條件下目的基因測得的熒光信號量同標準曲線進行比較，從而得到目的基因的量。在標準曲線法中，靶基因的標準曲線通常是由標準品進行連續(xù)稀釋所得，以起始拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標、Ct 值為縱坐標。由于質粒大量制備方便、穩(wěn)定、濃度高、定量準確，還可應用于實驗室內或不同實驗室之間的定量分析，故一般采用質粒作為標準品。本研究應用重組質粒倍比稀釋為標準品，得到的標準曲線的相關系數(shù)r為 -1.00。本實驗建立的SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測Bmi-1的方法具有較寬的定量范圍，在1.0×103～1.0×108copies/μL之間具有良好的線性關系。對于 SYBR GreenI實時熒光定量 PCR，其擴增產(chǎn)物長度最好在300 bp以下。本方法的目的基因Bmi-1及內參基因GAPDH擴增產(chǎn)物分別為226 bp和221 bp，以保證PCR擴增的高效率。

由于 SYBR Green I能夠非特異地結合于所有雙鏈DNA，所以一旦反應體系中出現(xiàn)非特異擴增，就會影響到定量結果的可靠性與重復性[8]。在SYBR Green I實時熒光PCR中，為了進一步確認反應的特異性，可對PCR產(chǎn)物進行熔解曲線分析。當只有特異性的PCR 產(chǎn)物形成時，在熔解曲線圖中只可見單一的峰。在本研究中， Bmi-1及GAPDH 的Tm 分別為80.4℃和84.4℃，熔解溫度均一，峰的形狀也較銳利。另外，對PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析也只有目的條帶，而沒有其他雜帶，表明本實驗檢測Bmi-1特異性好。

Bmi-1基因與造血系統(tǒng)惡性腫瘤及實體瘤的發(fā)生、發(fā)展相關，并為白血病干細胞自我更新所必需。Bmi-1基因在小鼠和人骨髓細胞中的表達水平與造血細胞的分化程度呈負相關，它在造血干細胞中高度表達，隨著造血干細胞向各系分化，Bmi-1基因表達水平下降。白血病是造血干細胞的惡性克隆性疾病，大量幼稚細胞無限制增殖，同時存在一定數(shù)量的白血病干細胞及祖細胞。本研究結果顯示，健康人外周血表達低水平的Bmi-1 mRNA，而急性白血病細胞中Bmi-1 mRNA表達明顯上調，說明該基因可能參與了急性白血病的發(fā)生，是一種新的腫瘤標志物。但Bmi-1基因能否作為急性白血病評價治療效果指標仍需擴大樣本量進一步研究探索。

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