DNMT1與UHRF1基因在胃癌細胞系中的表達特點及其與癌細胞DNA甲基化的關系*

王雪嬌，張開立，王宏宇，胡先福，李世杰，王 茜，李 宏，孫 媛

(1.大連醫科大學 臨床醫學系2007級; 2.遼寧省癌癥基因組重點室及大連醫科大學 細胞生物學教研室，遼寧 大連 116044)

胃癌(gastric cancer)是人體常見的惡性腫瘤[1]，其發病率有著明顯的地域性，在中國有包括大連在內的多個胃癌高發區并且胃癌總發病人數約占世界總發病人數的41%[2]。因此，了解胃癌發生、發展及轉移機制，制訂出適合本地區胃癌預測、早期診斷和早期阻斷的有效措施極為迫切。

胃癌的病因復雜，其發生發展是一個多因素參與的多階段復雜過程，涉及遺傳學(Genetics)與表觀遺傳學(Epigenetics)的改變。DNA甲基化是最主要的表觀遺傳學修飾方式之一。大量證據表明，腫瘤的發生與抑癌基因啟動子區異常高甲基化有關[3]。

在以往的工作中，作者對胃癌四個細胞系 MGC 803， BGC823，AGS， HGC-27的多基因多位點DNA甲基化特點(也稱CpG島甲基化表型，CpG Island Methylator Phenotype，CIMP)進行比較鑒定，結果發現MGC 803，BGC 823，AGS， HGC-27中的CIMP型依次為L， L， L和H。說明胃癌細胞系發生了不同程度的甲基化。但導致其不同程度甲基化的原因仍不清楚。

甲基轉移酶1(DNMT1)可以在模板鏈的指導下，使半甲基化的DNA雙鏈分子上與甲基胞嘧啶相對應的胞嘧啶甲基化[4]。近年的研究亦發現甲基化與UHRF1(ubiquitin-like with PHD and ring finger domains 1，也稱為ICBP90)基因負責編碼一類指環型E3泛素酶的亞家族成員有關[5，6]。

而有關胃癌細胞系中的 CIMP 型，與 DNMT1及 UHRF1的相關研究未見報道。本研究擬對上述研究進行分析，探討胃癌細胞表觀遺傳學改變的分子機制。

1 材料和方法

1.1 細胞系

實驗所需胃癌細胞系AGS和HGC-27購于中國科學院細胞庫。MGC803(人胃低分化黏液癌)和BGC823(人胃低分化癌)從北京腫瘤研究所引進。細胞用含10%胎牛血清,0.2%碳酸氫鈉和0.3% HEPES的DMEM培養液(Gibco,USA)加青霉素100 U/mL,鏈霉素100 U/mL在37℃ 5%二氧化碳和100%濕度的孵箱中培養至對數生長期。用0.25%胰蛋白酶和0.04% EDTA的無鈣，鎂離子的PBS混合液消化處理細胞，重懸細胞于培養液中，進行細胞計數。調整細胞密度，以2×105個/mL的密度分裝到含有培養液(pH7.2)的細胞培養皿中，混勻，將細胞懸液均勻鋪在培養皿中。對培養細胞的RNA提取與分析按下述實驗步驟進行。

1.2 RNA提取及RT-PCR

收集各實驗組的細胞，分別置于1.5 mL的離心管中，用Trizol試劑提取總RNA進行RT-PCR。

1.2.1 RNA提取：在每個裝有收集好細胞的Eppendorf管中加入200 μL TrizoL，搖勻，-20 ℃消化1 h；加入40 μL氯仿，輕輕震蕩15 s；室溫靜置3 min；離心(4℃，15 min×12000 g)；吸上清至新管同時加入100 μL異丙醇，搖勻，室溫靜置15 min；離心(4 ℃，10 min×12 000 g)，棄上清，用75%乙醇洗沉淀；離心(4 ℃，5 min×10 000 g)，棄去上清，晾干后用1‰ DEPC水20 μL溶解RNA；260 nm波長下測定總RNA濃度。

1.2.2 反轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)：反轉錄體系20 μL，含模板RNA 0.5 μg；依照TaKaRa RNA LA PCRTMKit試劑盒提供說明書進行操作，反應條件為：55 ℃ 30 min，99 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min；PCR反應體系15 μL，其中含：反轉錄液3 μL，MgCl20.9 μmol/L，10×LA PCR Buffer 1.2 μL，引物終濃度為0.225 μmol/L，TaqDNA聚合酶0.067 U，加水至15 μL。PCR反應條件：UHRF1引物序列(TaKaRa生物工程有限公司)： 上游: 5’-GTC GGA TCA TCT TCG TGG ACG-3’；下游:5’-CTG TTC CGC GGT CCT CTT GTT-3’[7]。95 ℃ 30 s,53 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s，32個循環，擴增片段長度為680 bp。DNMT1引物序列(TaKaRa生物工程有限公司)：上游： 5’- ACC GCT TCT ACT TCC TCG AGG CCT A -3’，下游：5’- GTT GCA GTC CTC TGT GAA CAC TGT GG -3’[8]；反應條件94 ℃ 預變性2 min，94 ℃ 35 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共循環35次，然后延伸72 ℃ 5 min; 擴增片段長度為335 bp，內參為β-actin。

擴增產物直接加入3 μL 6×溴酚藍載樣緩沖液混勻，2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像，并進行密度分析，觀察各組目的基因的表達情況。

1.3 統計學方法

所有數據用mean±SD標準差表示，采用單因素方差分析，對各組均數進行統計學分析，以P<0.01為差異有顯著性意義。

2 結 果

RT-PCR結果顯示，CIMP型不同的4個胃癌細胞系中DNMT1，UHRF1表達有所差異。DNMT1在CIMP-L型的MGC803和AGS中的表達水平較低，但在CIMP-L型BGC823和CIMP-H型HGC-27中明顯增加。與MGC803和AGS比較差異有顯著性意義(P<0.01)，DNMT1表達水平與CIMP型鑒定結果并不一致(圖1、表1)。而UHRF1在HGC-27中有高水平表達,與其他3個胃癌細胞系比較差異有顯著性意義(P<0.01),其表達水平與CIMP型基本一致(圖1、表1)。

圖1 4個胃癌細胞系中DNMT1與UHRF1表達特點及CIMP型鑒定結果

表1 4個胃癌細胞系中DNMT1及UHRF1的RT-PCR結果(與β-actin IOD的比值)

DNMT1UHRF1MGC8030.5271±0.02340.5151±0.0157BGC8230.9518±0.02551)2)0.5130±0.0223AGS0.5403±0.03900.5026±0.0240HGC-270.9179±0.04491)2)0.8066±0.01041)2)3)

1)與MGC803相比，P<0.01; 2)與AGS相比，P<0.01;3)與BGC823相比，P<0.01

3 討 論

胃癌是世界最常見惡性腫瘤之一。癌細胞的侵襲和轉移是影響其預后和療效的主要因素。侵襲性和轉移性是腫瘤細胞最為重要的生物學行為，涉及黏附、降解、運動和增殖過程，并經由淋巴道、血道或腔道轉移至靶器官和組織。這個復雜過程的完成，需要多種因子參與和相互作用，涉及遺傳學與表觀遺傳學改變。其中DNA甲基化是表觀遺傳學修飾的主要方式，其所致異常基因沉默與多數腫瘤發生有關。

DNA甲基化是表觀遺傳學修飾的最主要方式。它是在DNA甲基轉移酶(DNMTs)的作用下，以S腺苷蛋氨酸(SAM)為供體，將甲基基團轉移到胞嘧啶的第5位C原子上而形成5-甲基胞嘧啶。DNA甲基化具有序列特異性，主要發生在CpG二核苷酸的胞嘧啶上。通常情況下，基因組中的多數基因(包括全部管家基因和部分組織特異性基因)的5’啟動子區域富含CpG序列，稱為CpG島。其甲基化狀態直接影響基因的表達，這也是基因表達調控的重要方式之一。

一般而言，DNA甲基化會抑制基因的表達。發生在基因啟動子或其附近區域的甲基化將直接阻礙AP-2、c-Myc、E2F和NF-κB等轉錄因子與啟動子的結合，使基因不能轉錄或降低基因的轉錄水平。 同時，基因5’端的調控元件發生甲基化后能結合特定甲基化CpG序列結合蛋白(methyl CpG binding protein, MBP)，從而間接阻止轉錄因子與啟動子形成轉錄復合體。此外，甲基化還可以通過改變染色質的構象使染色質凝縮成非活性的高級結構[9]。因此，DNA甲基化可以導致基因沉默(gene silence)，去甲基化(demethylation)可以作為一個沉默基因重新激活(reactivation)的開關[10]。

在表觀遺傳學(epigenetics)研究中，基因啟動子區CpG島甲基化與腫瘤的發生發展有著極為重要的密切關系，特別是抑癌基因的CpG島甲基化問題在近年來愈來愈受到重視[11]。研究認為，異常甲基化與腫瘤的發生密切相關。DNA甲基化狀態的改變直接影響了抑癌基因表達、基因組的穩定性，并且與基因突變有關。

DNA甲基轉移酶(DNMTs)催化DNA甲基化的發生與維持，在有DNA異常甲基化機制參與發生的腫瘤細胞中常為過度表達。在以往的工作中，我們對胃癌四個細胞系 MGC803， BGC823，AGS， HGC-27的多基因多位點DNA甲基化特點(也稱CpG島甲基化表型，CpG Island Methylator Phenotype，CIMP)進行比較分析，共選擇p16，hMLH1，TIMP-3，MINT2和RASSFIA共5個位點進行甲基化檢測并將之分為三級：如果發現其中3～5個loci發生甲基化，則定義為CIMP-H；發現1～2個loci發生甲基化，則定義為CIMP-L；如果這5個位點沒有一個發生甲基化則定義為CIMP-N。結果發現MGC803，BGC823，AGS， HGC-22中的CIMP型依次為L，L，L和H。說明胃癌細胞系發生了不同程度的甲基化。本研究對胃癌細胞系中DNMT1的表達情況進行分析，發現在4種細胞系中，DNMT在BGC823和HGC-27中都高表達(P<0.01)，與CIMP型鑒定結果并不一致，即在DNMTs基因高表達的BGC823細胞系中，作者并沒有檢測到有多位點異常高甲基化的特征。這是否意味著存在其他甲基化調控機制的可能性？這種潛在的調控因素通過與DNMTs共同作用影響來保證甲基化狀態在DNA復制過程中的維持。因此，本研究進行進一步的探討。

UHRF1(ubiquitin-like with PHD and ring finger domains 1，也稱為ICBP90)基因負責編碼一類指環型E3泛素酶的亞家族成員。一般認為UHRF1可以通過編碼蛋白與特定的DNA序列結合，進一步召集組蛋白去乙酰化酶影響染色質的結構而發揮基因表達調控作用。近年來有學者指出，UHRF1蛋白具有一個甲基化DNA的結合區域——稱作SRA(SET and RING associated)域[5]。在DNA復制過程中，UHRF1蛋白對DNA甲基化狀態的維持發揮關鍵性作用——它可以識別半甲基化的DNA子鏈，并召集DNA甲基轉移酶1聚合在DNA鏈上，將半甲基化DNA雙鏈轉變成完全甲基化DNA。從而使得DNA甲基化狀態在復制和傳代過程中得到維持。

作者發現胃癌細胞系中UHRF1表達特點為只在HGC-27中高表達，而在MGC803、BGC823及AGS中表達程度較低(P<0.01)，與CIMP型鑒定結果基本一致，提示UHRF1的表達是DNMT1進行甲基化的重要環節，UHRF1和DNMT1的同時高表達可能是胃癌甲基化程度高的主要原因。

本研究成果不僅從理論上可以對DNA甲基化發生和維持的分子機制加以補充和完善，而且提供了一個非常重要的表觀調控關鍵分子UHRF1，對臨床腫瘤表觀遺傳干預具有非常重要的指導意義——為高發區胃癌的病因學分析以及臨床疾病預測、預防和治療提供重要的生物學指標。

[1] Vauhkonen M, Vauhkonen H, Sipponen P. Pathology and molecular biology of gastric cancer[J]. Best Pract Res Clin Gastroenterol， 2006, 20(4): 651-674.

[2] http://www-depdb.iarc.fr/globocan2002.htm.

[3] Kurkjian C, Kummar S, Murgo AJ. DNA methylation: its role in cancer development and therapy[J]. Curr Probl Cancer，2008, 32(5):187-235.

[4] Jeltsch A. Molecular enzymology of mammalian DNA methyltransferases[J].Curr Top Microbiol Immunol，2006，301(1):203-225.

[5] Avvakumov GV, Walker JR, Xue S, et al. Structural basis for recognition of hemi-methylated DNA by the SRA domain of human UHRF1[J]. Nature，2008，455(7214):822-825.

[6] Jeong S, Liang G, Sharma S, et al. Selective anchoring of DNA methyltransferases 3A and 3B to nucleosomes containing methylated DNA[J]. Mol Cell Biol，2009，29(19):5366-5376.

[7] GAO X, SUN Y, HUANG L, et al. Down-regulation of Caveolin-1 in Gastric Carcinoma and Its Clinical Bilogical Significance[J]. Chin J Cancer，2005,24(3):311-316.

[8] Abbady AQ, Bronner C, Bathami K, et al. TCR pathway involves ICBP90 gene down-regulation via E2F binding sites[J]. Biochem Pharmacol，2005，70(4)：570-579.

[9] Fang JY, Mikovits JA, Bagni Rl. Infection of lymphoid cells by integration-defective human immunodeficiency virus type 1 increases de novo methylation[J]. J Virol，2001，75(20):9753-9761.

[10] Yu N, Wang M.Anticancer drug discovery targeting DNA hypermethylation[J]. Curr Med Chem，2008，15(14):1350-1375.

[11] Kai-Li Zhang, Yuan Sun, Yan Li ,et al. Increased frequency of CpG island methylator phenotype and CDH1 methylation in a gastric cancer high-risk region of China[J]. Translational Oncol，2008，1(1):28-35.