缺氧誘導因子-1α及血管內皮生長因子在卵巢上皮性腫瘤中的表達*

李玉巖，韓 璐

(大連市婦產醫院,遼寧 大連 116051)

卵巢癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一 ，發病機制尚未完全闡明，缺乏有效的早期診斷及治療方法[1]。近年研究發現，缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)及血管內皮生長因子(VEGF)在惡性腫瘤的發生、發展中發揮重要的作用。本文通過對HIF-1α及VEGF在卵巢癌組織中表達的研究，擬明確HIF-1α及VEGF與卵巢癌臨床分期、分化程度、浸潤深度的關系以及兩因子之間的相關性，為卵巢癌的發病機理研究和診治提供新的思路與方法。

1 材料和方法

1.1 材料來源

選取大連市婦產醫院腫瘤科2006年1月～2007年12月間切除的卵巢癌組織58例，交界性腫瘤23例，正常卵巢組織38例(取自與腫瘤組織交界的正常組織)，切取部分病變組織10%甲醛固定，另取一部分置液氮保存。所有患者術前均未做過放化療。每例均有詳細的臨床資料，所有標本均經兩位病理醫師給予病理診斷。按FIGO標準進行臨床分期：Ⅰ期8例，Ⅱ期13例，Ⅲ 期29例，Ⅳ 期8例。按WHO分化標準，中高分化9例，低分化49例。

1.2 主要試劑

兔抗人HIF-1α多克隆抗體(Cat：sc-1164)購自武漢博士德生物工程有限公司；鼠抗人VEGF(C-1)單克隆抗體為Santa Cruz公司產品(Cat:MSsc7269)，SP超敏濃縮試劑盒購自福州邁新生物公司。

1.3 儀 器

Jim-xMV-Ⅲ型單垂直板電泳槽，大連競邁生物科技有限公司；Jim-x ps-9型，半干式轉移電泳儀，大連競邁生物科技有限公司；高速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；微量進樣器，法國Gilson公司。

1.4 免疫組化SP法檢測

1.4.1 實驗步驟：標本經10%福爾馬林固定，常規脫水石蠟包埋，作厚度3～4 μm的連續切片。3%過氧化氫室溫作用10 min，CB液微波修復15 min，涼至室溫，10%羊血清封閉15 min，兔抗人HIF-1α抗體工作濃度為1∶200，VEGF抗體工作濃度1∶100，4℃過夜。依次添加二抗和酶室溫放置15 min, DAB顯色。流水充分沖洗后蘇木復染，依次脫水，中性樹膠封片。以PBS代替一抗做陰性對照。陽性對照用已知陽性片按上述步驟進行。

1.4.2 結果判定：HIF-1α陽性細胞定位為胞漿或胞核著棕黃色，VEGF為胞漿著棕黃色。HIF-1α染色結果判斷：按切片中細胞核著色率和/或細胞質染色深淺分類，(-)：未著色;(+)：<1%細胞核染色或細胞質染成淺黃色;(++)：1%～10%細胞核染色或細胞質染成棕黃色;(+++)：>10%的細胞核或細胞質染成棕褐色。VEGF染色結果為胞漿著棕黃色，判斷按切片中著色細胞數量的比率分類，(-):0～5%細胞質被染色,(+):<25%細胞質被染色;(++):<50%細胞質被染色;(+++):≥50%細胞質被染色。

1.5 Western blot免疫印記

(1)蛋白印跡反應：切取凍存組織約0.2 g在PMSF裂解液中勻漿后，冰上放置30 min后，4℃下12000 r/min離心5 min,取上清蛋白比色法測總蛋白濃度。細胞裂解物與上樣緩沖液等倍稀釋，煮沸3 min后以每泳道100 μg總蛋白的上樣量上樣于7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳槽，進行電泳，直至溴酚藍達到凝膠底部，拔掉電源。將濾紙、硝酸纖維素膜剪成與凝膠同樣大小，浸泡于轉移緩沖液中平衡30 min后，電轉移40 min。5%脫脂奶粉37℃封閉2 h，HIF-1α抗體工作濃度為1∶400 ， VEGF抗體工作濃度1∶300，4℃過夜，TTBS漂洗10 min×3次，加二抗(1∶200)37℃ 1 h，TTBS漂洗10 min×3次，再加酶(1∶200 )37℃放置1 h，TTBS漂洗10 min×3次，DAB顯色3 min后終止。(2)結果采用UVP(CA91786)凝膠成相系統照相，記錄條帶的A值。

1.6 統計學方法

應用SPSS 10.0系統統計分析軟件包進行數據處理。分類數據變量資料的比較采用成組設計的兩樣本非參數檢驗,多個樣本的非參數檢驗，相關分析采用Spearman等級相關分析。

2 結 果

2.1 HIF-1α的表達

2.1.1 免疫組化結果：在58例卵巢癌組織中HIF-1α總陽性表達率為86.21%,其中強表達33例,中度表達10例, 弱表達7例,陰性表達8例。交界性腫瘤和正常卵巢組織陽性表達率分別為47.83%和13.16%，卵巢癌組織與交界性腫瘤及正常卵巢組織陽性表達率相比差異均有顯著性意義(P<0.05)，見圖1、2。

HIF-1α隨著臨床分期的增高而表達增強(P<0.05)。隨著病理分化的增加HIF-1α表達增強(P<0.05)，見表1。

2.1.2 Western blot免疫印記結果：在120 kD位置上可見HIF-1α蛋白條帶(圖3)，其平均A值在卵巢癌中為1705.33±181.88，在正常卵巢組織中的表達為450.17±165.53，在卵巢癌中的表達量是正常卵巢組織中的(4.58±1.73)倍,兩者比較差異有顯著性意義(P<0.05)。

表1 HIF-1α和VEGF的相互關系及各自的表達水平與組織類型、分化程度的及臨床分期的關系 (n)

圖1 卵巢癌HIF-1α胞核表達陽性SP法 (DAB染色×200)

圖2 卵巢癌HIF-1α胞質表達陽性

2.2 VEGF的表達

2.2.1 免疫組化結果：VEGF僅在細胞質中表達，正常卵巢組織、交界性腫瘤組織、交界性腫瘤組織及卵巢癌組織中均見VEGF的表達，其在卵巢癌組織陽性表達率為98.28%,其中強表達42例,中度表達12例,弱表達3例,陰性表達1例。VEGF在正常卵巢組織和交界性腫瘤組織中表達陽性表達率分別為57.89%、82.61%，三者兩兩比較差異均有顯著性意義(P<0.05)。VEGF的表達隨著卵巢癌臨床分期的增高而增強(P<0.05)，隨著病理分級的增加VEGF的表達增強(P<0.05，見表1、圖4)。

圖3 HIF-1αLane1:卵巢癌組織；Lane2:交界性腫瘤組織；Lane3:正常卵巢組織

圖4 卵巢癌VEGF胞質表達陽性1、2為卵巢癌組織，3為正常卵巢組織

2.2.2 Western blot免疫印記結果：在23 kD位置上可見VEGF蛋白條帶，其平均A值在卵巢癌中為710.52±115.03，在正常卵巢組織中的表達為184.59±70.45，在卵巢癌中的表達量是正常卵巢組織中的(4.32±1.55)倍,兩者比較差異有顯著性意義(P<0.05)，見圖5。

圖5 VEGFLane1:卵巢癌組織；Lane2:交界性腫瘤組織；Lane3:正常卵巢組織

2.3 卵巢癌組織中VEGF和HIF-1α蛋白表達的相關性

VEGF和HIF-1α的表達呈正相關(rs=0.536,P<0.05),見表1。

3 討 論

腫瘤的發生、發展與細胞的過度增殖和凋亡的減少有關,腫瘤細胞無限制的增殖是其主要的特征,而細胞增殖需要大量耗氧。研究證實缺氧是實質性腫瘤物理微環境的基本特征之一,是決定惡性腫瘤預后的重要因素[2]。腫瘤細胞的失控性生長、高代謝狀態使絕大多數腫瘤均存在缺氧因素。腫瘤細胞適應缺氧的策略,一是提高糖酵解速率,二是形成多血管體系。研究發現，HIF-1在腫瘤的能量代謝和血管生成等過程中起重要的調控作用，并可以促進腫瘤細胞的生長、浸潤和轉移等惡性生物學行為的發生[3]。

缺氧通常在距離功能性血管100～150 μm處發生。腫瘤組織氧分壓為0～20 mm Hg(1 mm Hg=1.333 kPa),大部分腫瘤組織的氧分壓低于2.5 mmHg,而正常組織為24～66 mmHg[4]。腫瘤組織的缺氧在腫瘤形成病理過程中異常重要,與腫瘤放、化療耐受及惡性進展、遠處轉移密切相關[5]。HIF-1是由120×103的HIF-1a亞基和(91～94)×103的HIF-1β亞基構成的異二聚體轉錄因子,均屬于堿性螺旋-環-螺旋(basic-helix-loop-helix) bHLH/PAS(PER-ARNT-SIM)家族成員。缺氧條件下HIF-1α降解受阻,胞質內HIF-1α積聚增多并發生核轉位,移至細胞核中與HIF-1β結合形成HIF-1,與目的基因HRG中的HIF-1α結合點結合,促進其轉錄,引起一系列細胞對缺氧的反應[6]。

研究表明，HIF-1α在前列腺癌、肝癌、胃癌、宮頸癌等多種腫瘤中呈過表達，并與腫瘤侵襲性強和預后差有關[6]。本研究結果顯示，HIF-1α在正常卵巢組織和卵巢良性上皮性腫瘤中無明顯表達，交界性卵巢腫瘤組織及卵巢惡性腫瘤中的HIF-1α陽性表達率逐漸增高。本文的檢測結果發現 33 例正常組織中均未見HIF-1α蛋白表達，而 58 例卵巢癌中HIF-1α陽性表達率為86.21%，在卵巢癌組織中, 癌腫的浸潤深度、病理分級和TNM分期與HIF-1α陽性表達呈正相關，分化程度越差、分期越晚的病例HIF-1α陽性表達率越高,提示HIF-1α在卵巢癌形成發展過程中起重要作用,表明HIF-1α的表達可能反映出卵巢癌部分的的生物學行為，與其他腫瘤中的研究結果相符合[7]。但這是否能作為預測卵巢癌侵襲轉移的一項重要指標還有待進一步的深入研究。HIF-1α在腫瘤組織中的表達增高可能有兩個方面的原因:首先,在腫瘤的缺氧微環境中,腫瘤細胞通過HIF-1α的過表達來調控靶基因VEGF合成,促進新生血管的生成,維持氧和代謝的穩定，促進自身的生長和轉移。其次,一些基因的突變活化了癌基因或通過滅活腫瘤抑癌基因的產物來增加HIF-1α的表達。

VEGF是一種相對分子質量為(34～45)×10的二聚體糖蛋白，為多肽類生長因子，它是內皮細胞特異性有絲分裂劑,能使血管內皮細胞變形、移動、分裂增殖，能增加血管通透性，是誘導腫瘤產生新生血管的最主要的細胞因子之一。其作用包括:①誘導血管內皮細胞增殖，促進新生血管內皮細胞生長;②增加血管通透性;③增加血管外纖維性凝膠而支持腫瘤血管內皮細胞生長，結果使腫瘤血管生成增加，腫瘤得到血液供應而持續生長。VEGF mRNA和蛋白在較多惡性腫瘤中表達，如在腎癌、膀胱癌、乳腺癌 、胃腸道癌及頭頸部癌中均呈高水平表達，其在腫瘤血管的形成中起關鍵作用。現已證實 VEGF在實體瘤的發生發展中發揮著重要作用[8，9]，在沒有新血管形成以前，腫瘤只生長到1～2 mm，不會發生轉移；而在新血管形成后腫瘤成數倍增長，轉移幾率隨之增高[9]。它能增加血管通透性，促進腫瘤血管形成，對腫瘤血管內皮細胞增殖遷移及腹水產生發揮著重要作用。Carron CP等[10]研究發現VEGF及其受體在婦科惡性腫瘤組織中的表達明顯高于相應的正常組織,VEGF及其受體的高水平表達與婦科腫瘤的侵襲、轉移密切相關。

本研究結果顯示，58例卵巢癌標本均有不同程度的 VEGF蛋白表達，其在卵巢癌組織陽性表達率為98.28%,其中強表達42例，主要集中在 Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌中；中度表達12例；弱表達3例；不表達1例。卵巢癌中，在正常卵巢皮質中未見到VEGF強陽性表達。VEGF水平升高生存時間縮短，這與文獻報道一致[11，12]。表明VEGF不僅與腫瘤惡性表型相關，在卵巢癌進展中起關鍵作用，其表達量與預后密切相關，可作為預測卵巢癌預后的一個間接指標。

VEGF基因表達受多種細胞因子、癌基因、抑癌基因產物及缺氧等因素的調控[13]。有研究證實，在VEGF的5′端增強子內存在HIF-1α結合位點,缺氧條件下,一方面, HIF-1α與VEGF5′端增強子結合后使VEGF的轉錄和表達增強,誘導VEGF對缺氧的反應,增加血管生成,使血液到達缺氧部位；另一方面, HIF-1α還可增加缺氧情況下VEGFmRNA的穩定性。因此,卵巢惡性腫瘤中VEGF高表達,HIF-1α也應該高表達,兩者應有明顯相關性[14]。本研究發現，在卵巢癌組織中VEGF和HIF-1α均呈高表達，而在正常組織中表達陽性率較低，隨著組織學分級的增加和臨床分期的提高，二者的表達強度和陽性率均有所提高，而在分化較好、臨床分期較早的組織中則表達較弱，陽性率低。這進一步證實了二者存在正相關性，HIF-1α是VEGF的表達調控因子之一。

同時檢測卵巢惡性腫瘤組織中HIF-1α及VEGF,不僅有助于卵巢癌的早期診斷和預測其侵襲性及預后,而且隨著研究的不斷深入,這一腫瘤生長調控的機制可為今后以HIF-1α和VEGF為靶點治療卵巢惡性腫瘤提供新的思路。

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