鼻咽癌組織淋巴細胞亞群的分布與分析*

宋 陽，王莉芬，石 林，杜翠萍

(1.大連醫科大學 附屬第一醫院 耳鼻喉科，遼寧 大連 116011；2.大連醫科大學 附屬第二醫院 病理科，遼寧 大連 116027)

鼻咽癌是中國高發惡性腫瘤之一，占頭頸部惡性腫瘤發病率的首位。其發生與遺傳因素、EBV及環境因素等有關[1]。機體免疫低下被認為是鼻咽癌發生的重要因素[2，3]。早期人們就開始關注鼻咽癌組織中淋巴細胞浸潤現象，且有作者報道鼻咽癌組織中淋巴細胞浸潤數量與預后有關[4]。也有人提出鼻咽癌組織中T淋巴細胞數量減少可能與腫瘤的發生發展有關[5，6]。國內外文獻報道多采用流式細胞技術檢測鼻咽癌患者外周血中淋巴細胞亞群的分布情況[7，8]，但有關鼻咽癌組織中淋巴細胞亞群分布的研究較少，而局部免疫應答更利于控制腫瘤的發生發展。本文采用免疫組化技術對比鼻咽癌組織與慢性鼻咽部炎組織中CD3+、CD4+、CD8+、 CD20+淋巴細胞情況，現將結果報告如下。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

45例鼻咽癌標本均來自大連醫科大學附屬第二醫院2002 年1 月～2007年9 月存檔蠟塊。男性37 例,女性8 例。年齡41～88歲,平均年齡64.5歲。其中，28例為未分化型非角化性癌;17例為分化型非角化性癌。33例伴頸淋巴結轉移，12例不伴淋巴結轉移；另取同期33例慢性鼻咽炎患者作為對照組，男性16 例,女性17 例。年齡33～74歲,平均年齡53.5歲。蠟塊均經再次切片，HE染色，光鏡觀察再次明確病理診斷。

1.2 方 法

1.2.1 試 劑：鼠抗人CD4單克隆抗體(Clone,ZM-0418)；兔抗人CD8單克隆抗體(Clone,ZA-0508)；兔抗人CD3多克隆抗體(Clone,RMA-0543)；鼠抗人CD20單克隆抗體(Clone，MAB-002)以上均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

KIT-5020快捷型酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物；SPKIT-AI動物非免疫血清(羊)，內源性過氧化物酶阻斷劑；DAB 顯色試劑，(DAB -0031/1031)，以上均購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.2.2 實驗方法：免疫組化方法：標本經4%中性甲醛固定，石蠟包埋,4 μm厚連續切片，進行常規免疫組織化學染色。

1.3 結果判斷

參照許良中免疫組化反應結果的判斷標準[9]。

CD3+、CD4+、CD8+、CD20+均以細胞質或細胞膜染色呈棕黃色為陽性表達；先用低倍鏡掃視整個切片,尋找淋巴細胞浸潤的高密度區域后,在高倍視野(40×10)下記錄5個視野,計數被染成棕色的淋巴細胞。陽性細胞數量占所有淋巴細胞的10%以內為(-),11%～ 25%為(+),26%～ 50%為(++),> 50%為(+++)。

1.4 統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件中的χ2檢驗，P<0.05為差異有顯著性意義。

2 結 果

2.1 HE染色結果

33例慢性鼻咽炎組織中上皮下淋巴組織均呈不同程度增生，26例形成濾泡，7例淋巴細胞彌漫性增生，并見數量不等的漿細胞浸潤及毛細血管增生。45例鼻咽癌均見少量淋巴細胞浸潤，癌組織間質內可見淋巴濾泡，少數標本癌旁組織(呈慢性炎癥改變)中可見淋巴濾泡。

2.2 免疫組化結果與分析

2.2.1 CD3+T淋巴細胞表達：鼻咽癌組織中CD3+T淋巴細胞陽性表達率(53.33%)與鼻咽炎組(81.82%)比較差異有顯著性意義；χ2=8.96，P<0.05(表1、圖2)。

2.2.2 CD4+T淋巴細胞表達：鼻咽癌組織中CD4+T淋巴細胞陽性表達率(20%)與鼻咽炎組(42.24%)比較差異有顯著性意義，χ2=4.60，P<0.05。(表2，圖3、4)。

2.2.3 CD8+T淋巴細胞表達：鼻咽癌組織中CD8+T淋巴細胞陽性表達率(77.77%)與鼻咽炎組(78.79%)比較差異無顯著性意義，χ2=3.51，P>0.05。(表3，圖5、6)。

2.2.4 CD20+B淋巴細胞表達

鼻咽癌組織中CD20+T淋巴細胞陽性表達率(48.89%)與鼻咽炎組(63.64%)比較差異無顯著性意義，χ2=1.89，P>0.05(表4，圖7、8)。

表1 鼻咽癌和慢性鼻咽炎CD3+T淋巴細胞 %(例數)

表2 鼻咽癌和慢性鼻咽炎CD4+ T淋巴細胞 %(例數)

圖1慢性鼻咽炎中CD3+T淋巴細胞(×200)

圖2鼻咽癌組織中CD3+T淋巴細胞(×200)

圖3慢性鼻咽炎中CD4+T淋巴細胞(×200)

圖4鼻咽癌組織中CD4+T淋巴細胞(×200)

圖5鼻咽癌組織CD8+T淋巴細胞(×200)

圖6慢性鼻咽炎CD8+T淋巴細胞(×200)

圖7鼻咽癌組織中CD20+B淋巴細胞(×200)

圖8慢性鼻咽炎中CD20+B淋巴細胞(×200)

表3 鼻咽癌和慢性鼻咽炎CD8+ T淋巴細胞 %(例數)

表4 鼻咽癌和慢性鼻咽炎CD20+ B淋巴細胞 %(例數)

2.2.5 鼻咽癌組織中CD4+/CD8+比值(0.26)比慢性鼻咽炎組(0.54)減少，明顯小于正常值(CD4+/CD8+比值正常為1.76±0.58)

3 討 論

本文觀察了33例慢性鼻咽炎及45例鼻咽癌患者的淋巴細胞亞群的分布情況。其中，33例慢性鼻咽炎組織，26例形成濾泡，CD20+B淋巴細胞密集分布于淋巴濾泡中，CD3+T淋巴細胞主要分布于濾泡周圍，說明在慢性鼻咽炎中B淋巴細胞占優勢，提示慢性鼻咽炎局部免疫以體液免疫為主。而在45例鼻咽癌組織中，各種淋巴細胞亞群分布均少于間質；同時本次實驗發現鼻咽癌組織中CD4+T淋巴細胞、CD3+T淋巴細胞較慢性鼻咽炎組減少，而兩組間CD8+T淋巴細胞、CD20+B淋巴細胞差異不明顯，且鼻咽癌組織中CD4+/CD8+比值(0.26)較慢性鼻咽炎組(0.54)減小，明顯小于正常值，提示鼻咽癌患者鼻咽部組織確實存在免疫功能紊亂，這主要是細胞免疫功能障礙所致。

近年來研究表明，腫瘤免疫分為細胞免疫和體液免疫，其中細胞免疫與腫瘤的發生發展及預后密切相關。在細胞免疫中T淋巴細胞是機體免疫防御系統的重要組成部分[10]，在腫瘤免疫監視及效應中起著重要作用。T淋巴細胞主要有兩類，CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞。CD4+和CD8+的總稱為T3(CD3+)。CD4+T淋巴細胞可以從多方面增強細胞免疫，誘導多種效應細胞殺傷腫瘤細胞，調節免疫反應的活性。 CD8+T淋巴細胞可抑制B細胞產生抗體，可對靶細胞發生細胞介導細胞毒作用,抑制免疫反應。研究表明，Th與Ts之間相互誘導和制約所形成的細胞網絡對于調控免疫反應及維持免疫自穩具有重要作用[11]。如果某些原因引起Th細胞減少和(或)Ts細胞增多,都會影響機體抗腫瘤的免疫功能。機體免疫功能正常時，可及時清除體內EBV以及發生惡性轉化的細胞 ；機體免疫功能下降時，尤其T淋巴細胞功能出現缺陷和協調紊亂時，EBV能逃逸免疫細胞的殺傷而持續感染，而且發生惡性轉化的細胞也能逃逸免疫細胞的殺傷而存活下來，最終致癌 。CD4+、CD8+細胞必須同時作用，T細胞抗腫瘤才能發揮良好的效果。因此，通過監測鼻咽癌組織中CD4+、CD8+及CD3+細胞數的變化對疾病診斷、藥物治療、預后有重要的指導意義[12]。

隨著腫瘤免疫學的發展，腫瘤的綜合治療必將成為主流。生物治療將成為腫瘤治療的常規療法，它與目前手術、放療、化療三大常規療法有明顯的協同，其抗腫瘤的特異性和免疫記憶是其他方法所不能比擬的，在防止腫瘤復發、轉移方面免疫治療的地位更為重要。目前，在鼻咽癌方面出現了EBV特異性過繼免疫治療[13]，并已成為腫瘤內科治療的研究熱點。過繼免疫治療是指向腫瘤患者轉輸具有抗腫瘤活性的免疫細胞，直接殺傷腫瘤或激發機體抗腫瘤的免疫效應，從而達到治療腫瘤的目的。具有高親和性的單克隆的T淋巴細胞或特異免疫功能是提高腫瘤免疫反應的關鍵[14,15]。本實驗中，局部CD3+、 CD4+均表達降低，提示能在局部開展特異性的過繼性細胞免疫治療，向其轉輸具有抗腫瘤活性的具有特異性殺傷效應的CD4+細胞，直接殺傷腫瘤從而達到治療腫瘤的目的。但具體實施過程有待于今后在實驗中更深層次的研究。

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