姜黃素與β-欖香稀聯用對涎腺腺樣囊性癌細胞株SACC-LM生長抑制和凋亡的協同作用*

白 亮，李耀輝，王 如

(大連醫科大學 附屬第一醫院 口腔頜面外科，遼寧 大連 116011)

抗癌藥物對腫瘤產生的效果不僅依賴于對腫瘤細胞增殖的抑制，同時依賴于誘導腫瘤細胞凋亡。評價抗癌藥物療效的重要標志是能否誘導腫瘤細胞凋亡。大量研究表明，姜黃素能抑制多種腫瘤細胞生長，如食管癌、鼻咽癌等有誘導其凋亡的細胞毒作用。姜黃素一方面有一定抗腫瘤作用，另一方面也能通過抗氧化機制保護正常細胞，可降低β-欖香稀的細胞毒作用。作者通過實驗探討姜黃素聯合β-欖香稀抑制涎腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma，SACC)細胞株SACC-LM細胞是否有協同效應，能否誘導其凋亡，并對凋亡誘導和細胞周期阻滯關系進行研究。既往國內外學者對姜黃素誘導腫瘤細胞凋亡有大量研究報道，但姜黃素協同β-欖香稀抑制涎腺腺樣囊性癌細胞株SACC-LM細胞增殖和誘導凋亡的研究鮮有報道。

1 材料和方法

1．1 研究材料

姜黃素：中國藥品生物制品檢定所提供；5%β-欖香稀乳劑：大連藥物化學研究提供；SACC-LM：北京大學口腔醫學院提供；Caspase-3鼠IgG和即用型SABC染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司提供，批號070206)

1．2 研究方法

1．2．1 藥物敏感性MTT測定法：將指數生長期的腫瘤細胞按每孔1×104個(1 mL)SACC-LM細胞接種到96孔培養板中，置37℃、5%CO2、100%濕度培養箱中24 h后，分別加入姜黃素、β-欖香稀及姜黃素聯合β-欖香稀(濃度比1∶1)3組不同用藥，每組藥物分別以0、10、20、40、80、160 μg/mL的濃度順次加藥，對照組加不含藥物的培養液，孵育24 h，棄上清液，每孔加含0.5 mg/mL的MTT溶液100 μL溫育1 h，棄上清液，加溶解液100 μL溫育0.5 h，搖勻后，用酶標儀在595 nm/630 nm波長測定，求A值。細胞存活率(%)=實驗孔A均值/對照孔A均值×100%

1．2．2 流式細胞術檢測細胞凋亡率：單獨加10 μg/mL姜黃素、單獨加10 μg/mL β-欖香稀、10 μg/mL姜黃素和10 μg/mL β-欖香稀聯合用藥，作用于SACC-LM細胞24 h，對照組不加藥的SACC-LM細胞培養24 h，共4組細胞。1000 r/min離心5 min，制成1×106個/mL懸液。取細胞懸液PBS漂洗2次，70%預冷乙醇固定，4℃ 2 h。制成200 μL細胞懸液，加Rnase 100 μL 37℃水浴30 min。加碘化丙啶，15 min后，上機分析(Facs Vantange SE)。

1．2．3 藥物對SACC-LM細胞株Caspase-3表達的影響：取對數生長期細胞制成細胞懸液，將其濃度調整為2.5×103/mL，接種于預置蓋玻片的6孔板中，貼壁后加入不同組的藥物溶液，使其終濃度為10 μg/mL,常規培養24 h后取出蓋玻片，用4%聚乙二醇固定，按照試劑盒方法進行細胞免疫組化染色，檢測Caspase-3蛋白的表達。顯微鏡下觀察：每張涂片隨機取10個視野，每個視野計數260～460個細胞，分別計數Caspase-3免疫陽性細胞數目和陰性細胞數目，進行統計學分析。

1．2．4 透射電鏡觀察：不加藥的SACC-LM細胞培養24 h后作對照組，以10 μg/mL姜黃素和10 μg/mL β-欖香稀聯合用藥作用于SACC-LM細胞24 h為實驗組。經漂洗、固定、脫水、包埋等制成電鏡標本，雙鉛染色后，透射電鏡觀察并攝片。

1．3 統計學方法

應用SPSS11.0軟件包進行統計學處理，單因素方差分析比較各組差異，結果以均數±標準差表示，以P<0.05為差異有統計學意義。計算各組半數抑制濃度(IC50)及95%可信區間，依據95%可信區間進行統計推斷，繪制姜黃素、β-欖香稀，以及姜黃素聯合β-欖香稀作用SACC-LM細胞的劑量-反應關系曲線圖。

2 結 果

2．1 細胞增殖實驗結果

姜黃素聯合β-欖香稀(濃度比1∶1)作用于SACC-LM細胞株，與兩種藥物單獨作用于SACC-LM細胞株相比，呈現出明顯協同作用。按Bliss法先測出姜黃素和β-欖香稀各自IC50；設其為相加作用，公式：1/混合物預期IC50=a/姜黃素IC50+b/β-欖香稀IC50，且a+b=1，a=b=0.5。單獨以姜黃素、β-欖香稀作用于SACC-LM細胞各自IC50的95%可信區間和姜黃素聯合β-欖香稀(濃度比1∶1)作用于SACC-LM細胞的IC50的95%可信區間不重疊，證明它們之間比較差異有顯著性意義(P<0.05)。見表1。在聯合作用SACC-LM細胞中，1/混合物預期IC50=0.5/69.45+0.5/186.81?；旌衔镱A期IC50=101.4。混合物預期IC50/實測IC50=101.4/30.47=3.32>2.5。證明姜黃素聯合β-欖香稀(濃度比1∶1)作用于SACC-LM細胞有協同作用。

表1姜黃素、β-欖香稀及它們聯合用藥對SACC-LM細胞毒性(IC50)μg/mL的影響

類別實測IC5095%可信區間姜黃素69.4558.34～89.51β-欖香稀186.81148.12～240.23聯合用藥1∶130.4724.87～37.65

時間相同，不同藥物直接作用于SACC-LM細胞后，細胞均出現體積變小、變形，甚至發泡、皺縮等變化。而聯合用藥(濃度比1∶1)對腫瘤細胞的抑制作用最強，其抑制率隨藥物濃度增加而增大，具有濃度依賴性，并繪制其藥物的量效關系曲線。見圖1。

圖1姜黃素/β-欖香稀/聯合用藥(濃度比1∶1)作用于SACC-LM細胞株的量效關系曲線

2．2 流式細胞術結果

對照組不加藥的SACC-LM細胞24 h后，G1期細胞比例74.87%，G2期細胞比例9.36%，S期細胞比例15.77%。

單獨加姜黃素后，G1期細胞比例40.89%，G2期細胞比例為36.39%，S期細胞比例22.73%，凋亡率10.53%，細胞阻滯在G2/m期。

單獨加β-欖香稀后，G1期細胞比例53.93%，G2期細胞比例0.06%，S期細胞比例46.01%，凋亡率13.54%，細胞阻滯在S期。協同作用后，G1期細胞比例33.57%，G2期細胞比例0.00%，S期細胞比例66.43%，凋亡率26.57%，細胞阻滯在S期，凋亡率明顯提高，見圖2。

2．3 不同藥物對SACC-LM細胞株Caspase-3表達的影響

經不同組藥物(藥物濃度10 μg/mL)處理過的SACC-LM細胞的細胞膜和細胞漿呈現棕黃色，細胞核染為藍色，其陽性表達都比對照組高，差異有顯著性意義(P<0.05)，而以聯合用藥組陽性表達最高，見表2。

組 別陽性率(%)陰性對照組2.9±0.3β-欖香稀組20.8±2.1姜黃素組14.1±1.5姜黃素+β-欖香稀組46.2±3.2

2．4 透射電鏡觀察

對照組細胞完整，內質網豐富，核仁大而明顯。聯合用藥組，細胞皺縮，核內染色質高度凝集，核染色質沿核膜發生邊聚，線粒體固縮或腫脹，內質網破裂，有凋亡樣壞死改變。見圖3、4。

3 討 論

姜黃素是從姜黃根莖中提取的一種酚性色素，具有抗腫瘤、抗氧化、抗HIV病毒等多種藥理作用，是一種天然植物活性成分[1]。β-欖香稀是從中藥莪術中提取的揮發油，對肝、腎功能無損害，毒副作用小。本實驗3組藥物姜黃素組、β-欖香稀組以及兩者聯合組均有抑制SACC-LM細胞生長的作用，但聯合組抑制率最高。當達到半數抑制率IC50時，姜黃素濃度(69.45 μg/mL)是協同用藥濃度(30.47 μg/mL)的2.27倍，β-欖香稀濃度(186.81 μg/mL)是協同用藥濃度(30.47 μg/mL)的6.13倍，說明在較高的濃度時，各組藥物主要通過直接殺死腫瘤細胞來抑制腫瘤生長，而聯合用藥組在較低的劑量下，也能顯示較強誘導腫瘤細胞凋亡作用，說明兩藥聯合誘導腫瘤細胞凋亡作用增強，有協同作用。

臨床腫瘤學中，通常以S期細胞比例作為判斷腫瘤增殖狀態的指標，在G1期，細胞開始RNA和蛋白質合成，但DNA含量仍保持二倍體；進入S期后，DNA開始合成，此時細胞核內DNA含量介于G1期和G2期之間，DNA仍未復制成四倍體。本實驗的可能機制為：聯合用藥(濃度比1∶1)作用SACC-LM細胞時，使姜黃素與β-欖香稀各自單獨作用SACC-LM細胞株的細胞阻滯周期發生改變，并使腫瘤細胞周期阻滯在S期，抑制了腫瘤細胞增殖，并有明顯增高的凋亡率，說明聯合作用可產生較早期細胞凋亡。聯合用藥組Caspase-3的陽性表達遠高于對照組(P<0.05)，差異有顯著性意義，活化的Caspase-3酶是早期細胞凋亡檢測的信號分子，聯合用藥組可激活Caspase-3，使Caspase-3表達明顯高于每個單獨用藥組，一旦依賴于Caspase-3的細胞水解過程被激活并啟動，細胞凋亡不可逆轉，同時裂解多聚苷核糖聚合酶和Caspase活化的脫氧核糖核酸酶抑制劑，最終導致腫瘤細胞DNA發生斷裂，即發生明顯凋亡。其結果與流式細胞儀檢測的細胞DNA片斷化出現時，細胞DNA正發生斷裂，細胞DNA未復制成四倍體前，發生S期細胞阻滯，凋亡率明顯提高的結果一致，也與電鏡顯示聯合用藥作用SACC-LM細胞出現明顯凋亡形態一致。

Caspase在凋亡中所起的主要作用是：滅活細胞凋亡的抑制物(如bcl-2)；水解細胞的蛋白質結構等。所以，聯合用藥組同時使bcl-2凋亡調控蛋白表達下調，bcl-2基因降低可提高細胞對協同用藥的敏感性，采用Caspase-3表達技術，更證實了聯合用藥是通過激活Caspase-3和下調bcl-2調控蛋白表達來誘導腫瘤細胞發生凋亡，也說明兩種藥物有協同作用。

姜黃素的藥理作用還有抑制氧自由基產生、抑制多種蛋白激酶活性等[2]。其毒副作用小，無明顯的肝腎毒性，故而成為許多國內外學者的研究對象。楊甫文等[3]報道，姜黃素的抗腫瘤作用機制在不同腫瘤細胞中可表達為抑制腫瘤血管生成，抑制多種酶和蛋白的活性，涉及多種基因的表達和傳導路徑。而Liu等[4]采用MTT測定法和免疫組化等技術研究報道，姜黃素可抑制Raji淋巴瘤細胞增殖，同時誘導其凋亡，其作用機制可能和上調組蛋白乙?；D移酶4蛋白表達等因素有關。又有Lim等[5]研究表明，姜黃素可通過上調抑癌基因p21、p53表達，抑制原癌基因MDM2,AP1等的表達。

圖3 對照組 透射電鏡×5000

圖4 聯合用藥組 透射電鏡×10000

姜黃素抗腫瘤機制較為復雜，多靶點、多途徑作用是其亮點。姜黃素與化療藥物聯合應用是目前化學預防和治療腫瘤研究熱點之一。本實驗姜黃素和β-欖香稀聯合抑制SACC-LM細胞增殖并誘導其凋亡的協同作用機制尚需進一步探討。姜黃素具有低毒、價低、來源廣等優點，而β-欖香稀可從資源豐富的天然藥物中尋求，較低濃度的姜黃素與β-欖香稀協同用藥即可達到較高抑制腫瘤細胞SACC-LM生長和誘導其凋亡的作用。從另一側面反應，降低了β-欖香稀用藥濃度，良好地發揮了姜黃素保護正常細胞的抗氧化機制。既達到殺傷腫瘤細胞的目的，又避免了高濃度的姜黃素和高濃度的β-欖香稀對正常組織細胞的細胞毒作用。本實驗是前期實驗的延續，選擇涎腺腺樣囊性癌SACC細胞系的不同細胞株SACC-LM進行研究，為臨床上防治涎腺腺樣囊性癌的進一步研究提供良好的科學實驗依據。由于涎腺腺樣囊性癌具有嗜神經、嗜血管性等生物學行為，化療在預防該腫瘤的復發、轉移中有重要地位。希望通過不斷的研究與探索，并摸索出成熟的化療方案，以促進臨床在治療涎腺腺樣囊性癌的措施方面有新的突破。

[1] Aggarwal S,Ichikawa H,Takada Y.Curcumin (diferuloylmethane)down-regulates expression of cell proliferation of Ikappabalpha kinase and Akt activation[J]. Mol Pharmacol,2006,69(1)：195-206.

[2] 許東輝，王勝，金晶，等.姜黃素的藥理作用研究進展[J].中草藥，2005，36(11)：1737-1740.

[3] 楊甫文，黃金中.姜黃素抗腫瘤研究機制進展[J]. 福州總醫院學報，2006，13(4)：248-251.

[4] Liu HL,Chen Y,Cui GH,et al. Curcumin,a potent antitumor reagent,is a novel histone deacetylase inhibitor regulating B-NHL cell line Raji proliferation[J].Acta Pharmacol Sin,2005,26(5):603-609.

[5] Lim,Zhang Z,Hill DL,et al. Curcumin,a dietary component,has anticancer,chemosensitization,and radiosensitization effects by down-regulating the MDM2 oncogene through the PI3K/mToR/ETS2 pathway[J].Cancer Res,2007,67(5):1988-1996.