超聲時間與藥材粒度對超聲法提取槐花米中蘆丁的影響*

張寶璟，張廣元，甄宇紅，于振龍，黃珊珊，馬驍馳，刁云鵬，舒曉宏

(1.大連醫科大學 藥物化學教研室，遼寧 大連 116044； 2.大連醫科大學 藥學院 2007級學生，遼寧 大連 116044)

蘆丁 (Rutin)，又名蕓香苷 (5,7,3′,4′,-四羥基-3-蕓香糖黃酮)，為廣泛存在于多種藥用植物及食物中的黃酮類化合物，其中以槐花米中含量為高，產率一般可達10%以上。蘆丁及其衍生物具有降血壓、降血脂、抗過敏及抗炎等多種生理活性[1,2]，在臨床上應用廣泛。目前，實驗室對蘆丁的提取方法通常采用的有堿提取酸沉淀法、連續回流提取法、乙醇浸漬法、滲漉法等。其中，以堿提酸沉法使用最多[3]。

近年來超聲提取技術在天然產物提取方面得到廣泛應用，超聲波通過溶液介質引起的空化作用，能夠加速藥材中有效成分的溶出，從而提高藥物有效成分的提取效率，成為一種天然藥物有效成分提取的新方法[4]。關于超聲法從槐花米中提取蘆丁雖有報道[5]，但對于超聲操作方法闡述不一。鑒于此，本研究在傳統堿提酸沉法[3]基礎上，將槐花米粉碎至不同的粒度及超聲提取不同的時間，觀察藥材粉碎度及超聲時間對蘆丁提取效率的影響。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

RT-08高速粉碎機，北京環亞天元機械技術有限公司；KQ3200DB型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；pHS-3C型酸度計，上海雷磁儀器廠；FA1004型電子天平，上海精密科學儀器有限公司；高效液相色譜儀(美國Waters公司)，配有Waters 1525二元泵及2487雙波長紫外檢測器；Inertsil ODS-3 C18柱(4.6×250 mm，5 μm)，日本島津公司。

槐花米，購自大連美羅大藥房；蘆丁標準品購自中國藥品生物制品檢定所(批號：0080-9705)；甲醇 (色譜純，Fisher Sci, USA)；磷酸、乙醇、濃鹽酸、氧化鈣及硼砂均為分析純，購自天津市博迪化工有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 槐花米細粉制備：稱取槐花米藥材，干燥后用粉碎機粉碎，收集經過分別經過1號篩、3號篩及5號篩的粉末，連同槐花米粗粉(未通過1號篩)各稱取20 g 進行超聲提取。

1.2.2 超聲輔助提取法：將槐花米粉末，每份20 g，加入蒸餾水300 mL，再加入硼砂1 g，石灰乳調至pH 9[3]，分別超聲(150 W、40 KHz、70℃)2、5、10、20、30、60 min，抽濾[4]。回收抽濾所得殘渣，重復以上操作1次。合并濾液，在室溫下用濃HCl調至pH3[3]，放置過夜。抽濾后得蘆丁粗品，置恒溫干燥箱中干燥，稱重。然后用蒸餾水按1g∶200 mL的比例進行重結晶，放置過夜，濾取沉淀并干燥稱重，計算蘆丁產率。

1.2.3 蘆丁的鑒定：取蘆丁樣品及標準品各3～4 mg，加乙醇5～6 mL，使其溶解，進行Mg-HCl及鋯鹽/枸櫞酸的顏色檢測；蘆丁的樣品及其標準品甲醇溶液，濾膜過濾后進行HPLC分析。色譜條件如下：色譜柱為Intersil ODS-3(4.6×250 mm，5 μm)，流動相為甲醇∶0.3 %磷酸(35∶65)，流速1.0 mL/min，檢測波長254 nm，柱溫35℃，進樣量10 μL[3]。

2 結 果

2.1 藥材粉碎粒度及超聲時間對蘆丁產率的影響

粉碎至不同粒度的槐花米粉末，超聲所得蘆丁產率在一定時間范圍內均與超聲時間正相關，而后呈平臺趨勢(圖1)，但隨著超聲時間延長，過濾困難，操作時間明顯延長(圖1)。粉碎粒度不同，提取產率也不同，顆粒越小，提取效果越好(圖2)。5號篩粉末提取效率最高，但過濾困難，操作總時間延長，故但當粒度<3號篩后，提取率沒有明顯提高。綜上因素，在本實驗條件下，采用過3號篩的粉末超聲5 min即達到較高的提取產率(16.46%)，從而大大地縮短了反應時間。

圖1 槐花米粉碎粒度及超聲時間對蘆丁產率的影響

*代表粉碎至不同粒度的槐米粉末達到較高提取產率所需時間(粗研粉末：30 min; 1號篩粉末：20 min; 3號篩粉末：5 min； 5號篩粉末：5 min)

圖2超聲時間為5 min時間點不同粉碎粒度槐米的蘆丁產率

*3號篩產率為 (16.46±2.0)%；5號篩粉末產率為 (16.79±2.1)%

2.2 樣品的鑒定

樣品甲醇溶液加入鹽酸-鎂粉后溶液呈紅色；樣品甲醇溶液加入鋯鹽后顯黃色，再加入枸櫞酸后黃色褪去。上述反應與蘆丁標準品一致。

提純的蘆丁樣品經HPLC分析，在tR= 9.132 min處出現單一色譜峰(圖3A)，紫外圖譜顯示該峰在256 nm 與357 nm 附近有最大吸收(圖3 B)，該圖譜與蘆丁標準品的保留時間及紫外吸收基本一致(圖3C、3D)，故所提樣品為蘆丁。

圖3 蘆丁樣品及標準品的HPLC、UV光譜A 蘆丁樣品的HPLC (tR=9.117 min)；B 蘆丁樣品UV光譜 (λmax=256 nm; 357 nm)C 蘆丁標準品的HPLC (tR=9.132 min)； D 蘆丁標準品UV光譜 (λmax=257 nm; 358 nm)

3 討 論

超聲波提取技術在中藥有效成分提取中的應用日趨廣泛，其通過液體介質引起的空化作用可造成植物細胞壁的瞬間破裂，便于提取溶劑滲透到植物細胞中，從而加速藥材中有效成分的溶出，并且超聲波提取不會改變有效成分的結構，同時減少溶媒用量、提高了提取效率，因而成為一種植物有效成分提取的新方法[5]。

在以往的實驗操作如煎煮法、浸漬法中，藥物一般不宜細粉，但超聲法中因超聲波是一種彈性機械振動波，通過介質作用局部可產生巨大壓力和千度高溫，從而適于微粉化原料藥的提取，促進植物細胞破壁，使細胞內的有效成分充分暴露出來，迅速、完全地釋放到適宜溶劑中，因而提高提取效率。

本實驗將槐花米粉碎至不同粒度，較短時間超聲下，蘆丁產率隨粒度減小而升高，但粉末<3號篩后，過濾明顯困難，操作時間延長，可能由于粉末過細阻塞濾紙所致。同時，相同粒度粉末超聲所得蘆丁產率在一定時間范圍內與超聲時間正相關，到達一定時間點后，蘆丁粗品產率雖有提高，但精制蘆丁產率卻略有下降，并且過濾困難，其原因可能是隨著超聲時間延長，雜質含量增加，而蘆丁在高頻率偏堿性的條件下也可能發生一定程度地降解。與一般文獻報道采用乙醇為提取溶劑的超聲法[6]比較，本研究采用堿液對微粉的槐花米進行超聲提取能夠明顯縮短反應時間，并顯著提高提取效率。雖然，超聲法提取的產率較以前傳統酸堿法的產率稍低[3]，但能夠大大地縮短反應時間，從而明顯地提高了蘆丁提取效率。因此，藥材微粉化與超聲法結合將為天然藥物中有效成分的提取提供一種新的思路。

[1] 臧志和，曹麗萍，鐘鈴. 蘆丁藥理作用及制劑的研究進展[J]. 醫藥導報，2007,126(17):758-760.

[2] Chen KC, Hsieh CL, Huang KD, et al. Anticancer activity of rhamnoallosan against DU-145 cells is kinetically complementary to coexisting Polyphenolics in Psidium guajava budding leaves [J]. J Agric Food Chem，2009,57(14):6114-6122.

[3] 舒曉宏，馮梅，陳華，等．槐花米中蘆丁提取最佳pH值的實驗研究[J]．大連醫科大學學報，2005,27(2):91-92．

[4] 馬國剛，王建中，盧曉蕊. 響應面分析法優化槐米蘆丁超聲波提取工藝的研究[J]．食品與發酵工業，2007,33(8):167-172.

[5] 吳立軍. 天然藥物化學[M]. 第5版.北京：人民衛生出版社，2007.19.

[6] 郭玉，唐國濤，陳淑嫻，等.槐花米中蘆丁提取方法的比較研究[J]．中成藥，2007，29(11):1675-1677.