柑橘種間體細(xì)胞雜種的核質(zhì)遺傳研究

摘要：為了解柑橘體細(xì)胞雜種的核質(zhì)遺傳組成，采用流式細(xì)胞儀(FCM)、簡單序列重復(fù)(SSR)、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(sRAP)以及酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(CAPS)對此前通過對稱融合獲得的2株種間體細(xì)胞雜種進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，在丹西紅橘+紅江橙種間組合中，分析的2株植株中1株為二倍體非對稱體細(xì)胞雜種，其核DNA具有雙親的部分DNA，并有重組發(fā)生，胞質(zhì)DNA則來源于紅江橙(葉肉親本)；而另1株則是異源四倍體體細(xì)胞雜種，其核DNA來源于雙親，并有重組發(fā)生，胞質(zhì)DNA則來源于紅江橙。

關(guān)鍵詞：柑橘；體細(xì)胞雜種；FCM；SSR；SRAP；CAPS

中圖分類號：S666

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1009-9980(2010)02-183-05

自獲得首例柑橘體細(xì)胞雜種以來，柑橘原生質(zhì)體融合取得了較大的進(jìn)展，研究涉及的類型不斷增多，研究的范圍也不斷擴(kuò)大，研究的手段也得到了提高。20D0年以前，獲得的絕大多數(shù)柑橘體細(xì)胞雜種，由于研究手段限制或花費(fèi)較高僅根據(jù)同工酶或RAPD分析確定其雜種性，而沒有分析其核和胞質(zhì)DNA來源。隨著分子標(biāo)記的增多(如AFLP、SSR和CAPS等)，柑橘體細(xì)胞雜種核質(zhì)遺傳研究也趨于簡捷。

我們于1999年采用原生質(zhì)體融合獲得了丹西紅橘+紅江橙種間組合體細(xì)胞雜種，其雜種性已被RAPD分析所確認(rèn)。該組合目前有2株體細(xì)胞雜種，生長勢較旺，其中1株的葉片與紅江橙相似，長橢圓形，有翼葉，屬于葉肉親本再生類型；而另外1株為多倍體形態(tài)特征，葉片大、肥厚、葉色深。我們采用FCM、SSR、SRAP以及CAPS對這2株種間體細(xì)胞雜種進(jìn)行了核質(zhì)遺傳分析。該研究有利于從遺傳本質(zhì)上認(rèn)識柑橘體細(xì)胞雜種雜交過程中的遺傳規(guī)律，可以研究柑橘體細(xì)胞雜種核質(zhì)互作，了解柑橘核質(zhì)組成對體細(xì)胞雜種田間表現(xiàn)的影響，為選配融合親本提供理論指導(dǎo)，為柑橘體細(xì)胞雜種應(yīng)用于育種實(shí)踐奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 材料

本試驗(yàn)中丹西紅橘(Citrus reticulata)+紅江橙(C. sinensis Osbeck cv．Hongjiangcheng)融合組合獲得的2株植株于2001年移入田間。

1．2 倍性分析

供試材料的倍性鑒定用德國PaYee GmbH公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀完成。參照Xu等的方法并做適當(dāng)修改。取0.5cm2的幼嫩葉片置于小培養(yǎng)皿中，加入0.5mL的Panec HR-A溶液用刀片切碎，處理3min后，將樣品通過30μm的Partec Celltrics^TM微孔膜過濾到測試管中，加入Partec HR-B2mL，然后用Panec倍性分析儀測定樣品單個細(xì)胞核的DNA總量。樣品DNA含量的分布曲線由倍性分析儀自動生成。

1．3 總DNA的提取、SSR分析、CAPS分析

總DNA的提取參照Liu等的方法。取4～5g幼嫩葉片加入適量液氮研碎后，加入CTAB DNA提取緩沖液，65℃水浴。純化后，最后溶于TE成分中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

SSR分析參照Liu等的方法，并稍加改動。本研究中共選用了4對核基因組SSR引物，即TAA1、TAA15、TAA45、TAA41，引物由上海生物工程公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在Peltier-200熱循環(huán)儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系為20μL，其中含50ng模板、1.0U TaqDNA聚合酶、1×緩沖液、1.5mmol·L^-1MgCl₂、0.2mmol·L^-1dNTPs和正反向引物各0.1μmol·L^-1。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃變性1min，55℃退火40s，72℃延伸2min，擴(kuò)增32個循環(huán)后72℃復(fù)性10min。擴(kuò)增產(chǎn)物加熱煮沸變性后，在6％變性聚丙烯酰胺凝膠(含0.5倍TBE)上分離，在恒定功率60W下電泳約2h或二甲苯氰(Xylene Cyanol FF)指示劑距離凝膠底部約1/2處。電泳結(jié)束后，用銀染法得到被擴(kuò)增的DNA譜帶，銀染過程參照銀染測序試劑盒Q4130技術(shù)手冊(Promega，美國)。

CAPS分析參照Demesure等文獻(xiàn)，使用5個葉綠體和3個線粒體通用引物在PTC-200熱循環(huán)儀中對總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為(50μL)：100ng模板、2.0mmol·L^-1MgCl₂、0.2mmol·L^-1dNTPs、2.5U Taq DNA聚合酶、1×緩沖液和正反向引物各0.1mmol·L^-1。擴(kuò)增程序與SSR分析的相同。取6μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在用5U限制性內(nèi)切酶(本實(shí)驗(yàn)共使用了11種，包括HaelII.Hinfl，Hindlll.MspI，TasI，TaqI，RasI，AluI，DraI，MboI，MseI等)保溫3～4h，在2.0％的瓊脂糖凝膠(含5μg·mg^-1EB)中2.5V·cm^-1電泳2～3h，在紫外燈下照相；或者酶切產(chǎn)物在6％變性聚丙烯酰胺凝膠上，恒定功率(85W)電泳約1.5h，銀染檢測并拍照。

1．4 SRAP分析

參照Guo等的方法并做適當(dāng)修改。25μL SRAP反應(yīng)體系為：1×PCR緩沖液，1.5mmol·L^-1MgCl2，100μmol·L^-1dNTPs，0.4μmol·L^-1隨機(jī)引物，1U TapDNA聚合酶，100ng DNA模板，去離子水定容；擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃1min，37℃1min，72℃10s，5個循環(huán)；94℃1min，50℃1min，72℃10s，35個循環(huán)；72℃1min；保存溫度4℃。擴(kuò)增完畢后，使用2.0％瓊脂糖膠(含EB0.5mg·L^-1)電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳條件為1×TAE電泳緩沖液，恒壓2.5V·cm^-1，隨后在紫外投射儀上觀察并照相；擴(kuò)增引物序列見表1。

2 結(jié)果與分析

2．1 倍性分析

取葉肉親本紅江橙和再生體細(xì)胞雜種葉片，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行了倍性分析。對照(紅江橙)葉片相對熒光強(qiáng)度值設(shè)為50(圖1)，分析的植株1和2分別為47.77和95.19，表明它們分別為二倍體和四倍體。

2．2 核DNA來源

2．2．1 SSR分析 4對SSR引物中，TAA15和TAA1揭示了多態(tài)性。引物TAA1中紅江橙的帶型包含了丹西紅橘的帶型，2株體細(xì)胞雜種與葉肉親本紅江橙帶型一樣(圖2-A)；在引物TAA15中，雙親各有一條特征帶和共有帶，但2株體細(xì)胞雜種擁有雙親的特征帶而缺失了其共有帶(圖2-B)；此外，在雙親沒有差異的引物TAA27中，2株體細(xì)胞雜種多出了1條新帶(圖2-C)。結(jié)合倍性分析以及3對引物的分析結(jié)果，可初步推斷：這2株體細(xì)胞雜種的核DNA可能分別具有雙親部分核DNA(DH1植株)、全部核DNA(DH2植株)，并都有重組發(fā)生。

2．2．2 SRAP分析 7對引物組合中，2個組合在親本間顯示了差異。引物組合me1/em1中，紅江橙有2條帶，而丹西紅橘僅1條，2株體細(xì)胞雜種與葉肉親本紅江橙帶型一致(圖3-A)；在引物組合me3/em3中，丹西紅橘與紅江橙各有2條和1條特征帶，二倍體植株DH1具有雙親各1條特征帶，同時丟失了丹西紅橘1條特征帶，另外還有1條弱的新帶，而四倍體植株DH2綜合了雙親的全部帶型(圖3-B)。可見，SRAP分析結(jié)果與SSR相似，也印證了上面的推斷。

2．3 胞質(zhì)DNA來源

體細(xì)胞雜種的mtDNA和epDNA組成分析中，1個線粒體引物/酶組合(18S-5S rRNA/TasI)和2個葉綠體引物，酶組合(trnH-trnK/TasI和trnH-trnK/Hin-II)在親本間檢測到差異。當(dāng)用于分析體細(xì)胞雜種時，這2株體細(xì)胞雜種的帶型與葉肉親本(紅江橙)完全一致，體細(xì)胞雜種之間也沒有差異(圖4)。表明葉肉親本提供體細(xì)胞雜種的胞質(zhì)基因。

FCM、SSR、SRAP和CAPS分析結(jié)果表明丹西紅橘+紅江橙再生植株DH1和DH2都是體細(xì)胞雜種。其中DH1為二倍體非對稱體細(xì)胞雜種，其核DNA具有雙親的部分DNA，并有重組發(fā)生，胞質(zhì)DNA則來自葉肉親本；而DH2是異源四倍體體細(xì)胞雜種，其核DNA具有雙親的DNA，并有重組發(fā)生，胞質(zhì)DNA也來自葉肉親本。

3 討論

本研究中，所分析的種間組合“丹西紅橘+紅江橙”，其2株體細(xì)胞雜種分別為二倍體非對稱體細(xì)胞雜種和四倍體體細(xì)胞雜種，它們的胞質(zhì)基因全部來源于葉肉親本。在柑橘上，這是第一次從對稱融合再生非對稱的葉肉親本型二倍體體細(xì)胞雜種的報(bào)道。從分析結(jié)果和植株形態(tài)上看，該非對稱雜種核基因組可能具有葉肉親本紅江橙大部分的核DNA和懸浮親本丹西紅橘少數(shù)的核DNA，并有重組發(fā)生。如采用GISH技術(shù)將有可能進(jìn)一步揭示該體細(xì)胞雜種的核基因組成。對稱融合產(chǎn)生非對稱雜種的現(xiàn)象在其他作物也時有發(fā)生，如小麥、油菜、煙草等。但大多數(shù)都在屬間組合發(fā)生，可能是由于偏遠(yuǎn)的遺傳背景引起核—核或核—質(zhì)不親和，為了正常的分裂和生長需要，在融合體內(nèi)不占優(yōu)勢的某一親本核DNA被全部或部分排除。對于種間組合“丹西紅橘+紅江橙”，兩親本之間雜交是親和的，說明核—核不親和可能不是導(dǎo)致其非對稱性的主要因素，并且在該組合還存在1株含雙親核基因組的四倍體體細(xì)胞雜種，這也間接地表明了雙親核基因組間是親和的。此外，對稱融合時兩親本原生質(zhì)體由于所處的分裂時期不一致或分裂速度不同，在培養(yǎng)階段某一親本的核基因組被逐漸排除或發(fā)生重組，也是產(chǎn)生非對稱體細(xì)胞雜種的原因之一。在我們這一組合中，后一種原因可能占主導(dǎo)地位。

在該組合中，胞質(zhì)基因全部來源于葉肉親本，這與以前報(bào)道結(jié)果是不同的。據(jù)已有關(guān)于體細(xì)胞雜種胞質(zhì)遺傳分析的報(bào)道，二倍體葉肉親本再生類型體細(xì)胞雜種的線粒體都來源于懸浮系親本。看來葉肉親本再生類型體細(xì)胞雜種不一定需要懸浮系親本的線粒體。那么，除了該組合外，為什么葉肉親本再生類型體細(xì)胞雜種的線粒體都來源于懸浮親本?為什么懸浮親本的線粒體在生長過程中占優(yōu)勢?諸多相關(guān)機(jī)理還不太清楚。如果同時對雙親的線粒體采用不同的熒光標(biāo)記，追蹤觀察其動態(tài)變化，將有助于解釋該現(xiàn)象。