杧果炭疽病抗性雜交群體的構建及SSR分子標記鑒定

摘要：以對炭疽病高抗的金煌品種為母本，高感的愛文品種為父本構建杧果炭疽病抗性雜交群體，共獲得雜交果實219個，培育雜交實生種苗184株。按花朵統計結實率為218％。通過對184株雜交種苗進行SSR分子標記鑒定，結果表明，16對引物中15對能夠有效擴增產物；12對具有豐富的多態性；8對在父母本之間具有多態性，184株雜交種苗可以確認是真實雜種，應用SSR分子標記技術可以對杧果雜種的真實性進行快速驗證。

關鍵詞：杧果；炭疽病；雜交群體構建；SSR；雜種鑒定

中圖分類號：S667.7 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2010)02-265-05

杧果炭疽病是杧果最嚴重的病害，此病在國內外杧果產區普遍發生，以高抗品種金煌為母本，高感品種愛文為父本進行人工雜交授粉，以期建立杧果炭疽病抗性雜交群體。由于杧果人工雜交授粉技術在我國一直是個難題，雜種的真實性有必要進行鑒定，在應用SSR(簡單重復序列)分子標記方法進行杧果相關研究方面，主要集中在品種鑒定、遺傳多樣性分析等方面，有關應用SSR分子標記方法進行杧果雜種真實性鑒定未見報道，我們以SSR分子標記方法進行杧果雜種真實性鑒定，以期建立一種新型、準確、快速有效的分子生物學檢測杧果雜種真實性的方法。

1 材料和方法

1．1 雜交授粉

試驗于2007年11月下旬至12月上旬在海南三亞廣州甘蔗糖業研究所海南甘蔗育種場杧果試驗基地進行，以對炭疽病為高抗的金煌品種為母本，高感的愛文品種為父本，采用姚全勝等杧果雜交授粉方法進行授粉試驗，共授粉679個花序，10066朵花。親本對炭疽病的抗性結論依據雷新濤等的鑒定結論。

1．2 雜種鑒定

1．2．1 基因組DNA的提取、檢測、PCR擴增、電泳檢測 2008年7—8月分3次采集雜交種苗幼葉材料，2008年7月在雜交授粉地采集親本幼葉材料，參照王家保等的方法提取杧果DNA并進行檢測。使用德國Whatman Biometra公司生產的T1型擴增儀進行PCR擴增，反應體系如下：2μL10×Ex TaqBuffer、1.6μL25mmol·L^-1MgCl₂、0.25μL4×dNTPMixture、1μL10μmol·L^-1Forward primer、1μL10μmol·L^-1Reverse primer、2μL20mg·L^-1基因組DNA、0.15μL5U·μL^-1Taq DNA polymerae、12μLddH₂O_o。擴增程序為：預變性94℃2min30s：變性94℃30s，退火48～54.4℃45s，延伸72℃1min；循環數為35，最后72℃延伸5min，4℃保存備用。電泳檢測采用8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，120V穩壓電泳1.2～1.5h，電泳結束后銀染顯色，并對條帶進行觀察記錄。

1．2．2 SSR引物及其退火溫度的優化與多態性分析 根據Viruel等的結論合成引物，引物序列如表1所示，引物合成由上海英駿公司完成。按1.2.1PCR擴增方法優化退火溫度，設定退火溫度為(48～68℃)，PCR儀自動生成12個溫度梯度：48、49、50、52、54.4、56.8、59．2、61.6、64、66、67、68℃。根據雷新濤等的結論，用16對引物分別對親緣關系較近的11個品種(包括親本)愛文、金煌、Carbao、海豹、臺農1號、Zill、粵西1號、Spooner、小菲、白象牙、串杧進行多態性分析，篩選能夠進行雜種鑒定的引物序列。

1．2．3 雜交群體的SSR分子標記鑒定 根據引物的多態性分析結果，選取在父母本之間具有多態性的引物共8對進行雜交種苗的親本真實性鑒定，在這8對引物中有4對引物具有以下特征：每個雜交種苗的電泳條帶與父本或母本之間沒有多態性，根據這個特征判斷電泳條帶與父本之間沒有多態性的雜交種苗為真實雜種。有1對引物具有以下特征：父本電泳條帶只有一個位點且與雜交種苗電泳條帶無多態性，判斷有這個特征的雜交種苗也為真實雜種。

2 結果與分析

2．1 雜交授粉結實率

于2008年4月收到雜交果實219個，2008年7月獲得雜交種苗184株。結實率按花朵統計為2.18％，雜交果實播種出苗率為84.02％。

2．2 SSR引物的退火溫度與多態性

經過優化，不同引物的退火溫度如表2所示，圖1為引物Lmma7、Lmma8的優化退火溫度電泳圖。經分析，不同引物在11個品種間和父母本之間具有豐富的多態性，16對引物中15對能有效擴增，其中12對在11個不同品種中表現出豐富的多態性，多態性引物占75％。大部分多態性引物可擴增出2條以上清晰條帶，其中在父本愛文，母本金煌之間具有多態性的引物有8對，這8對引物中有4對引物具有以下特征：每個雜交種苗的電泳譜帶與父本或母本之間沒有多態性(表3)，圖2為引物Lmma9、Lm-mall、Lmma12、Lmma16的多態性分析電泳圖。

2．3 雜種真實性鑒定結論

根據每株雜交種苗的電泳條帶與父本或母本之間沒有多態性引物Lmma2、Lmma6、Lmma10、Lm-mall的電泳條帶分析結論，分別有87、62、94、99株雜交種苗的條帶與父本的條帶沒有多態性(引物Lmma6只統計了127株雜交種苗個體)，184株雜交種苗中有167株符合至少有1對引物的條帶與父本的條帶沒有多態性，判斷這167株雜交種苗為真實雜種(圖3)。

根據父本電泳條帶只有一個位點且與雜交種苗電泳條帶無多態性引物Lmma3的電泳條帶分析結論，所有雜交種苗的條帶符合這個特征，判斷有這個特征的另外17株雜交種苗也為真實雜種，具體電泳圖譜如圖4所示。

3 討論

植物基因的遺傳分析大多是利用不同基因型進行雜交，通過后代的分離進行遺傳規律分析，因此，雜種的真假對遺傳分析的順利進行極為重要。傳統的形態學鑒定存在容易受到環境影響，在苗期鑒定可靠性低的弊端，查新顯示本文所獲得杧果雜交群體目前是我國最大的一個杧果炭疽病抗性雜交群體，所以在幼苗期進行雜種鑒定有利于加快抗炭疽病育種的相關研究，分子標記鑒定是進行幼苗期雜種鑒定最為可靠、有效的方法。由于SSR分子標記的重復性和穩定性好并且具有高度的多態性等特征，在棉花、櫻桃、油菜等作物的雜種鑒定上均有應用，因此選擇SSR分子標記進行杧果雜交種苗的親本真實性鑒定，母本不需要鑒定，實際是對雜交種苗的父本真實性進行鑒定。本文選擇了親緣關系較近的11個品種(包括父母本)進行引物的多態性分析，是因為進行雜交種苗的親本真實性鑒定需要引物具有較好的多態性，特別是在父母本之間有豐富多態性的引物，因此選擇親緣關系較近的品種進行引物多態性分析是可靠的。

本文主要依據所有雜交種苗的電泳條帶與父本或母本之間沒有多態性的4對引物進行判斷親本真實性，原因是構建雜交群體的過程是嚴格按照雜交授粉隔離程序進行的，其理論上的結果應該是沒有受精結實或者結實就是真實雜種，所以本文親本的真實性鑒定實際是一個驗證試驗。