椰子ISSR遺傳多樣性分析

摘要：應用ISSR技術分析了來自多個國家的30份椰子品種或類型的遺傳多樣性。用29條多態性較好的引物共擴增出了157條條帶，其中多態性條帶110條，多態性比率70％；用NTSYS軟件計算出這30份材料的DICE相似系數在0.548～0.962，平均值為0.788。其中相似系數最高的是紅矮(14號)和雜交種(16號)為0.962，最低的是海南高種(29號)和斐濟高種(5號)僅0.548。用uPGMA方法構建聚類樹，所有材料在相似系數0.79處被劃分為三大類(類群A，B，C)。A類群包括所有引進的高種、矮種和雜交種，B類群包含了除雄樹以外的所有特殊變異類型椰子，而來自海南的所有高種單獨聚為C類。綜合研究結果表明我國海南的椰子種質資源多樣性水平不高，需要進一步引進國外優良種質。

關鍵詞：椰子；遺傳多樣性：ISSR

中圖分類號：S667.4 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2010)02-238-06

椰子(Cocos nucifera L.)是棕櫚科重要的作物之一，用途廣泛，經濟壽命長。目前，多數椰子研究專家一致認為椰子起源于東南亞和南太平洋之間的地區，而我國的椰子是否為原產或人為引種自此中心尚無定論。不同的栽培環境使其產生了較大的差異，因此世界各地存在著不少變種、品種和類型，其中印度的國際種質庫有椰子種質材料126份。至今為止，已經有600份椰子種質在椰子遺傳資源數據庫(Coconut Genetic Resources Database Ver.4/CO-GENT/IPGRI)中登記。其分類研究多是依據椰子形態特征和酶，尚沒有統一的標準，這對椰子的選育種工作造成了很大的阻礙。ISSR分子標記法是由Zietkiewicz等提出的一種錨定SSR新技術，具有穩定性好，多態性豐富，信息量大，實驗操作簡單、快速等優點；還可以揭示整個基因組的一些特征，并呈孟德爾式遺傳；且由于SSR在真核生物中的分布非常普遍，并且變異速度非?？?，因而錨定引物的IS-SR-PCR也可以檢測基因組的許多位點的差異，已用于水稻、大豆咖啡等糧食和經濟作物的遺傳多樣性研究。本文旨在用ISSR分子標記法揭示我國椰子種質資源的多樣性水平，為今后的引種、種質保存和育種工作提供分子水平上的分類依據。

1 材料和方法

1．1 材料

試驗材料為30份，種植于中國熱帶農業科學院椰子研究所種質圃，其名稱和編號見表1。

1．2 DNA的提取與ISSR-PCR擴增

各供試材料均取自椰子植株的最幼嫩部分(嫩黃色的葉片)，采用改良的CTAB法㈣提取所有樣品的基因組DNA，通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量，用分光光度計測定其濃度，取部分稀釋備用。PCR反應體系是20μL：其中10×Taq Buffer(Mg²⁺25mmol·L^-1)2.5μL，10mmol·L^-1dNTPs0.5μL，5U·μL^-1Taq DNA oolymerase 0.2μL，25mg·L²⁺ DNA 2μL，20μmol·L^-1引物0.8μL，14μL無菌雙蒸水。反應程序：94℃預變性5min，94℃變性45s，72℃延伸90_s.35個循環，最后72℃充分延伸10min，4℃保存，引物由上海生工生物技術有限公司合成，PCR擴增在Biometra公司的T1PCR儀上進行。擴增產物加入2μL 6xLoadingBuffer，用2％瓊脂糖膠(每100mL加入5μLGoldVieWTMDNA染料)電泳分離，電泳緩沖液是0.5xTBE，6V·cm^-1電壓電泳60min，在Tanon4100凝膠成像系統中觀察拍照。

1．3 數據統計

將所得圖片采用人工計數，同一位置條帶有記為1，無記為0，資料缺失記為9建立Excel表格數據庫，所用軟件為NTSYSpe Version 2.10y，聚類分析按UPGMA(unweighted pair group method arithmeticaverages)法進行。

2 結果與分析

2．1 引物擴增多態性

利用優化的反應體系從96條ISSR引物中篩選出了29條帶形清晰、重復性好的引物進行統計分析，結果(表2)顯示29條引物對30份材料擴增出157條條帶，其中有110條多態性條帶，擴增的條帶1～11條不等，平均為5.4條。引物多態性百分率變幅為25％～100％，平均為70％，說明供試的椰子材料遺傳多樣性比較豐富。其中多態性最好的引物有UBC808、823、827、828、849、874，擴增條帶最多的引物為UBC855。擴增條帶的大小是：200～2000bp，多數為400～1500bp。

2．2 遺傳相似系數

基于ISSR數據計算出這30份椰子種質材料的DICE相似系數在0.548～0.962，平均值為0.788。在這些材料中遺傳相似性最大的是14號紅矮和16號雜交種，相似系數為0.962，其次是20號小黃椰和16號雜交種相似系數0.955：相似度最小的是29號，海南高種和5號斐濟高種(0.548)，其次是29號海南高種和6號羅圖馬，相似系數是0.554。另外，高科，材料的平均相似系數為0.771，低于30份材料的平均值，矮種和雜交種的最高為0.858，海南高種的為0.822，特殊變異類型椰子(22～26號)的是0.836。

2．3 聚類分析

圖2給出的是30份椰子種質材料基于ISSR標記的聚類圖。在相似系數0.79處可以將所有材料分成A、B、C 3個類群，A類群包括所有引進的高種、矮種和雜交種，其相似度在0.81以上，在0.84處又可以被分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ6個亞類群，第Ⅰ個亞類由引進的4個高種材料構成：西沙種、菲律賓高種、馬來亞種和馬高；另外的5份引進高種材料聚成第Ⅱ亞類，第Ⅲ亞類由幾乎是所有的矮種和雜交種均聚成，其平均相似系數值也最高為0.858，這就可能與其授粉方式有關；但也有個別例外，如馬來矮種獨自分離為第Ⅳ亞類；17號文椰和雄樹則分別為第Ⅴ、Ⅵ亞類；B類群包含了除雄樹以外的所有特殊變異類型椰子；C類群由所有的海南高種組成，相似系數高達0.822，說明其遺傳基礎相對狹窄。

3 討論

3．1 椰子ISSR標記的多態性

在對這30份椰子種質材料的ISSR擴增中29條引物擴增的條帶從3～11條不等，共157條，多態性條帶從1～9不等，共110條，其中引物UBC855擴增出的條帶(11)和多態性條帶(9)都是最多的，這與Manimekalai等舊的引物UBC855MI值最高說明此引物的多態性信息量豐富，還有多態百分比為100％的引物UBC808、823、827、828、849、874都可以作為將來的大規模篩選椰子種質資源的重要選擇。這29條引物的多態性比率平均值為70％，低于Manimekalai等的77％，這可能是由于實驗中忽略了大量稍微模糊的條帶，只統計了絕對清晰的條帶所致，但要遠遠高于Upadhvay等的45％，他用RAPD標記分析了印度81份椰子種質材料的多樣性和遺傳關系，但Manimekalai等舊對來自世界各地的33份椰子材料又進行的親緣關系RAPD標記分析結果顯示45條引物的多態性比率為74％，平均每條引物擴增出了8.9條多態性條帶；這可能與所選材料的多少或者種質類型的遺傳基礎差異有關。雖然有以上問題的存在，但ISSR仍是評價椰子遺傳多樣性和親緣關系的一種有效的分子標記方法。

3．2 椰子種質資源的遺傳多樣性

本實驗的椰子ISSR擴增結果表明，椰子的DICE遺傳相似系數在0.548～0.962，平均為0.788，說明供試椰子種質的遺傳多樣性不高，這與Perera等㈣對斯里蘭卡椰子種質材料的AFLP分析得出遺傳相似度高達81％從而評定其遺傳基礎狹隘的結果相似。所有供試高種椰子材料的平均遺傳相似系數是0.771，要低于所有材料的0.788更低于矮種和雜交種的0.858，說明高種的多樣性水平要高于矮種和雜交種的，此現象已經被Perera等，Lebrun等，Meerow等吲報道。在聚類圖中引進的所有高種分別聚為兩亞類，幾乎所有的矮種和雜交種聚為一亞類，但這些來自多個國家和地區的品種并未按照各自來源聚類，而是交叉聚于A類中，說明各品種的地理來源與遺傳差異沒有必然聯系；Perera等，Meerow等也曾發現菲律賓高種與來自東南亞的高種聚在一類。來自西非的西非高與來自斐濟的羅圖馬、斐濟高種和馬來西亞的馬高、馬來高聚在一起，這類似與Lebmn等的聚類結果，香水椰子和泰國矮的相似系數高達0.943，有力證明了香水椰子是泰國矮的一個變種；另外，來自海南的一些特殊變異類型聚為B類，說明這些種質有其獨特性，與其他品種有著相對較遠的遺傳距離，應當作為種質資源長期保存，但是雄樹卻聚在A類群中，一方面可能與擴增位點數目較少引起聚類偏差的緣故，另一方面，可能實生后代種植于種質圃內多年保存，一些性狀發生變異，從而造成遺傳基因漂移的緣故，仍需驗證。聚為C類的海南高種的平均遺傳相似系數高達0.822，說明海南高種的遺傳差異很小。其中4個海南高種在聚類圖中聚為一類，與其他種質的遺傳差異較大，應在以后的育種工作中充分發掘海南高種的遺傳潛力，將海南高種的優良和特異性狀基因逐漸轉入到椰子品種中來。

4 結論

從96條ISSR引物中篩選出了29條，對30份國內外椰子種質材料進行ISSR-PCR分析，共擴增出157個位點，其中由110個是多態性位點，多態性位點比率約為70％，DICE遺傳相似系數平均值為0.788，說明這些材料多樣性不高，海南高種與世界其他地區的椰子種質資源存在這較大的差異，所以在今后的種質資源保護、整理和利用工作時應對其加以重視，應作為一種重要的親本加以利用，以拓寬育成品種的遺傳背景。