山西綿核桃無融合生殖特性研究

摘要：山西綿核桃是我國核桃重要的栽培類型，以山西綿核桃為試材研究了其無融合生殖特性。套袋隔離結果表明，4個供試核桃單系均具有一定的無融合生殖能力，平均無融合生殖率為20.4％，最高達67.4％；方差分析結果顯示不同地區來源單系間無融合生殖能力的差異達極顯著水平，說明山西綿核桃群體中存在專性無融合生殖類型。山西綿核桃無融合生殖胚由卵細胞發育而來，屬孤雌生殖類型。具無融合生殖特性的山西綿核桃后代葉片過氧化物酶同工酶酶譜一致性高于自然授粉后代。討論了培育具無融合生殖特性的核桃新品種的可能性。

關鍵詞：山西綿核桃；無融合生殖：套袋隔離；胚胎學；同工酶

中圖分類號：S664.1 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2010)02-221-06

山西省是我國北方主要的核桃(Juglans regiaL.)產區之一，在幾乎遍布全省的兩大核桃林帶中，商品核桃產量的80％以上還是來自于實生繁殖的綿核桃品種群。由于實生繁殖造成的單株間性狀分化普遍，這就形成了核桃優系選擇的物質基礎。人們很早就發現核桃具有無融合生殖特性，無融合生殖后代基因不發生分離，其基因組成與母本完全相同，雖然經過有性生殖過程但母本的優良性狀不發生分離；或在授粉不良情況下仍可正常結實，保持一定產量。因而具有無融合生殖特性的核桃品種在苗木繁殖及穩定核桃產量方面具有重要意義。我們在前人研究核桃無融合生殖現象的基礎上，從套袋隔離、細胞學、胚胎學、同工酶等方面對山西綿核桃的無融合生殖現象進行了比較系統的研究，重點探討了無融合生殖核桃后代的特點，旨在對核桃無融合生殖現象有一個較深入的認識并為核桃優良品種的選育提供理論指導。

1 材料和方法

1．1 材料

套袋隔離材料為山西省核桃主產區分布的綿核桃成齡大樹，樹齡40～50a生，調查其來源為山西綿核桃(品種群)的嫁接苗，本文稱之為不同的單系。立地條件為黃土丘陵區(孝義)、土石山區(古縣、左權)及平原區(太谷)，2006年田間套袋隔離試驗由于4月11日的大雪凍害而無結果。試驗地位于山西晉中市(北緯37°25′，東經112°25′)，地勢較平坦，海拔800m，年均溫為9.8℃，年降雨量為456mm，無霜期120～176d，土壤為沙壤土，灌溉條件良好，管理水平一般。同工酶材料和實生苗觀察來源于播種當年及2a生無融合生殖和自然授粉的左權綿核桃實生苗，播種于園藝學院園藝站。室內試驗于2003年3月—2006年11月在山西農業大學園藝學院果樹學重點實驗室進行。

1．2 方法

1．2．1 去雄套袋隔離 于4月份核桃雌花露出但未開放時對不同地區的4個供試單系，每單系定點選5株樹，在樹冠外圍四周選發育正常的結果枝1～2個掛牌，每單系選3～5個雌花進行套袋。套袋時先摘除雌花附近的雄花序，保證羊皮紙袋內無雄花。同時隨機選擇20～30朵雌花不套袋作為對照，掛牌標記。10～15d后去除紙袋，去袋后1周分別調查套袋和不套袋雌花的坐果率。用去雄套袋的雌花數與自然授粉坐果數的比值表示無融合生殖率，并以此表示無融合生殖能力。試驗重復3a，試驗所得數據用SAS軟件進行統計分析。

1．2．2 無融合生殖核桃胚胎學觀察 從2003年3月25日—5月10日，每天上午10:00～11:00，采左權綿核桃雌花(芽)5個，固定保存方法同雄花序。采用常規石蠟切片，切片厚8～10μm，鐵礬蘇木精染色，OlympusBX50F-3型顯微鏡觀察并照相。2004年重復此試驗。

1．2．3 無融合生殖幼苗過氧化物酶同工酶的研究2004、2005年春季將前一年采集到的左權綿核桃無融合生殖果實和自然授粉果實獲得的種子播種于實驗田，作好標記，常規管理，7月中旬采集葉片做過氧化物酶同工酶的研究。試驗時每單株取小葉2～3片，用濕紗布包裹，冰壺帶回實驗室，0℃研磨勻漿，提取液為預冷的0.05mol·L^-1磷酸緩沖液(pH7.1)+5％(V/V)巰基乙醇，冷凍離心機0℃離心15min，離心力10000g。采用PowerPacTMBasic Basic型穩壓穩流電泳儀(美國Bio-Rad)進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。分離膠為7.5％(pH8.9)，濃縮膠為2.5％(pH6.7)，電極緩沖液為tris-甘氨酸緩沖液(pH8.3)。采用穩壓電泳0℃條件下進行。電泳完畢，剝膠，沖洗，用改良聯苯胺法染色，數碼相機拍照記錄。

2 結果與分析

2．1 核桃去雄套袋隔離試驗結果

從表1可以看出，供試核桃各單系都具有一定的無融合生殖能力。4個單系無融合生殖率最低為0，最高達67.4％。3a的調查資料表明，年度間無融合生殖能力的差異最大，年度間差異大的原因或許是氣候因素影響的結果。在無融合生殖能力表現最差的2004年，4個供試單系只有左權綿核桃表現有較高的無融合生殖能力(13.3％)。在4個單系整體表現較高的2003及2005年，左權綿核桃的無融合生殖能力遠遠高于其余3個單系，年間平均值的差值(26.4％/5.5％)達4.8倍。方差分析結果表明，不同地區來源的單系間無融合生殖能力的差異達極顯著水平。

2．2 核桃無融合生殖胚的胚胎學觀察

試驗結果表明，核桃為單子房，胚珠直生(圖版一A)，成熟胚囊為蓼形胚囊。未受精的卵細胞有絲分裂形成2個大小相等的2細胞原胚(圖版-B，C)，進而發育成8細胞原胚、球形原胚(圖版-D，F)，此后球型胚進一步發育成無融合生殖多細胞胚。

2．3 無融合生殖幼苗葉片過氧化物酶同工酶(POD)分析

試驗中共出現2條較清晰的酶帶(圖1)，酶帶遷移率分別為Rf0.38和Rf0.29，其中Rf0.38為強帶，Rf0.29為中等強帶，Rf0.38表現百分率較高，為特征帶。以過氧化物酶同工酶的酶譜在各單株間出現的頻率計算酶帶表現百分率，用其平均值代表整齊度。試驗中CK為自然授粉實生繁殖的同齡山西綿核桃幼樹，酶帶一致性低(49％)，無融合生殖來源的山西綿核桃后代酶帶一致性較高(88％)，該結果與以遼核1號為試材的結果近乎一致。理論上的酶帶一致性應達到100％，但同工酶試驗的實際操作中，從采樣到電泳各環節均可影響酶活及酶譜表達，各種誤差的存在導致很難達到理論值。

酶是基因直接表達的產物，同工酶酶譜的整齊度直接表示了遺傳物質的純合程度。本試驗結果顯示無融合生殖后代葉片過氧化物酶同工酶酶譜一致性高于對照，表明無融合生殖幼苗的遺傳背景的一致性比實生后代高，性狀發育整齊一致，分離幅度小。

2．4 具無融合生殖的核桃種子萌芽生長特性調查

2．4．1 出苗率觀察 從表3中可以看出，所收獲的綿核桃果實中無融合生殖來源核桃的空殼率高(指果實只有堅硬的外殼以及種皮，而沒有子葉)，2a平均達到7.1％，而自然授粉來源核桃的空殼率只有0.5％。無融合生殖來源核桃的播種出苗率也較低，2a平均出苗率為74.1％，而自然授粉來源核桃出苗率達到96.8％，遠高于無融合生殖來源核桃。對于未能出苗的無融合生殖來源核桃進行檢查，發現許多種子發育不完全，子葉缺少1/4～2/4。具孤雌生殖特性新疆早實核桃的播種出苗率平均為40.36％，遠低于普通核桃的出苗率；國外的資料顯示為16.7％～50.0％，說明為一普遍現象。

無融合生殖核桃的球形胚出現時期較正常自然授粉的核桃晚，無融合生殖胚的發育速率也慢，這可能是導致核桃成熟時空殼或癟仁的一個重要原因。成熟堅果中種子發育不全，除了胚本身發育緩慢外，可能還與無融合生殖胚發生較晚及無融合生殖果實與正常授粉受精果實間因營養競爭而導致的發育滯緩有關。

2．4．2 生長情況調查 在2005年11月對2a生苗進行株高調查，調查結果及分析見表4。由表4可知，無融合生殖來源后代平均株高較自然授粉來源后代低，對株高進行u檢驗，結果達極顯著水平，表明在核桃中無融合生殖來源后代株高相對自然授粉來源后代有明顯降低的趨勢。前者株間株高變異系數為0.2，后者達到0.4，可見無融合生殖來源后代的變異系數比對照自然授粉來源后代小，這說明無融合生殖來源后代的分離程度要比有性生殖來源后代小。這可能是由于無融合生殖來源后代在其種子發育過程中，未經雌雄配子體結合的過程，不存在雜合體的性狀分離問題，所以實生后代能表現出整齊一致的特點。

3 討論

3．1 核桃無融合生殖現象的遺傳表現及利用價值

植物的孤雌生殖特性受何類基因控制目前尚無定論，有人認為植物的孤雌生殖特性受多個單基因控制，有關其分子水平作用機理的研究正在深入進行。據有關資料核桃無融合生殖現象可分為專性和兼性無融合生殖2種類型，前者即為基因控制的類型，而后者很可能是環境脅迫后產生的一種反應，也可能是基因型與環境脅迫互作的結果。比如，在正常情況下無融合生殖現象不表現，當核桃雌花受隔離袋或環境脅迫雌花不能正常授粉受精時，孤雌生殖基因表達，使核桃正常坐果。

本試驗結果也表明，核桃中存在有專性和兼性無融合生殖的2種類型，4個品種單系中每年均表現有無融合生殖特性的單系應當是專性無融合生殖類型，而其余則是兼性無融合生殖類型。方差分析結果顯示各品種間無融合生殖能力差異極顯著。試驗中左權綿核桃在3a間無融合生殖率有較大差異(14.6％～67.4％)，是受不同年度的溫度變化影響的結果，這與王國安等的結論相同，其他品種類型2004年無融合生殖率很低或干脆不表現，與其兼性無融合生殖能力有關。左權綿核桃無融合生殖能力較穩定，年度間差異小，呈現專性無融合生殖類型。這種性狀的表現表明其具有穩定的遺傳基礎，是核桃優良的種質資源，可以用于具無融合生殖特性核桃新品種的選育，具很強的生產應用潛力。

通過套袋隔離，使雌花不能授粉受精，從而表現出自身的無融合生殖能力是人們常用的方法，這對雌雄異花的核桃來說尤為適用。到目前為止，有許多人對核桃和蘋果屬的無融合生殖能力進行了研究。但就采用的方法來說主要是以去雄套袋方法為主，也有采用給雌花柱頭授以同種類死花粉或異種活花粉，即所謂的蒙導法。就其試驗效果，由于套袋隔離的效應而使得套袋法的效果明顯而穩定。

有關核桃無融合生殖能力，雖然國外很早就有人研究，國內近年報道已逐漸增多，先后涉及到20多個品種單系的無融合生殖能力研究，但相對于全國800多個核桃品種及其眾多的單系類型來說，所做的工作還遠遠不夠。

3．2 核桃無融合生殖胚胎學研究

對無融合生殖的細胞胚胎學進行研究的方法雖有多種，但以石蠟切片法應用較多，該法是系統地觀察胚珠解剖結構的一種有效方法，尤適用于早期發育的觀察，可以系統地觀察胚珠及其他細胞的形態特征等，這些內容對于鑒定無融合生殖的機制是十分關鍵的。

無融合生殖種子中胚和胚乳的來源，是眾多研究無融合生殖現象的人所關注的重點。準確地判定胚和胚乳的來源可以知道胚的倍性，從而對無融合生殖進行分類，但目前核桃上的研究資料很少。陳躍鋒等認為核桃無融合生殖胚由卵細胞發育而來，屬孤雌生殖類型。卵細胞自發分裂形成2細胞原胚，4細胞原胚到多細胞球型原胚，進一步發育為無融合生殖胚，兩極核融合并分裂形成胚乳細胞，本試驗再次證實了上述觀察結果。

3．3 關于無融合生殖幼苗過氧化物酶同工酶分析

植物同工酶是植物生長發育和遺傳學研究的生化指標。Kuhns等研究玫瑰葉片不同發育時期的同工酶變化，表明過氧化物酶隨葉片生長發育，酶帶活性增加，當葉片成熟時較為穩定。成鎖占等對核桃多種同工酶研究也表明，接近成熟至衰老前的葉片，整個年周期中一年生枝的皮部、休眠芽的同工酶譜很穩定，不受環境條件、栽培條件及砧木類型的影響。所以本試驗中采集7月中旬的成熟葉片作為同工酶分析材料。

同工酶應用于植物無融合生殖研究，具有速度快、成本低、多態性高的特點，在木本果樹植物的無融合生殖研究中得到廣泛應用。用柑橘葉的葡萄糖磷酸異構酶和葡萄糖磷酸變位酶同工酶分析5個月的柑橘苗，根據同工酶譜足可以將合子胚與珠心胚細胞起源的不定胚區分開來。錫金海棠(Magussikkimeniis)等植物中的無融合生殖植株除生長發育整齊一致和能單性結實外，過氧化物同工酶酶譜整齊度也比較高。研究結果發現錫金海棠無融合生殖植株的譜帶表現百分率都在80％以上，小金海棠高達100％，而對照山定子只有50％。這說明無融合生殖來源后代遺傳物質的純合程度高于有性生殖來源后代。植物同工酶有組織特異性和階段特異性，是植物生長發育和細胞分化研究的很好的生化指標。本試驗結果表明無融合生殖山西綿核桃后代過氧化物酶同工酶酶譜一致性高于自然授粉實生后代。無融合生殖核桃為二倍體無融合生殖，其基因應該是純合的，后代表型整齊一致，遺傳上具有穩定性，表現出同工酶酶譜的一致性高。過氧化物酶同工酶酶譜整齊度越高，無融合生殖能力越強，過氧化物酶酶譜帶型一致性可作為無融合生殖特性的一個間接證據。

3．4 關于無融合生殖核桃堅果的質量評價及其利用價值

從本試驗結果可以看出，無融合生殖來源核桃的空殼率較高而堅果質量不高，這造成了其來源的核桃播種出苗率低。這對要求利用無融合生殖特性進行品種選育的育種家提出了一個嚴峻的問題：無融合生殖核桃種子發育不完全，由于子葉缺少而降低了堅果質量已是一個不爭的事實；但無融合生殖來源核桃成熟時空殼或癟仁的比率并不很高，本試驗結果2a平均值為7.1％，而在自然授粉來源的核桃中空殼率也有0.5％。這說明影響成熟堅果種子發育的眾多因素中，除了無融合生殖特性這個品種本身原因外，可能還與環境條件有密切的關系，特別是樹體的立地條件和營養狀況等，由于缺乏系統的研究資料，需要進一步開展深入研究。

4 結論

山西綿核桃實生群體中有具較高無融合生殖能力的單株，且部分株系表現為專性無融合生殖類型，該無融合生殖的胚由卵細胞發育而來，屬孤雌生殖類型。具無融合生殖特性的山西綿核桃后代葉片過氧化物酶同工酶酶譜一致性高于自然授粉后代。利用該特性進行核桃分子遺傳學研究和培育新品種將是今后工作的重點，前景廣闊。