根癌農桿菌介導寒富蘋果轉化體系的建立

摘要：以寒富蘋果組培苗葉片為外植體，利用植物表達載體上含潮霉素抗性基因的根癌農桿菌EHA105(pCAMBI-A1301)和含卡那霉素抗性基因的根癌農桿菌EHA105(pcAMBIA2301)對影響寒富遺傳轉化效率的因素進行系統研究。結果表明，寒富葉片對潮霉素反應敏感，在附加潮霉素的培養基上寒富葉片褐化較為嚴重。潮霉素和卡那霉素適宜的篩選質量濃度分別為4mg·L^-1和25mg·L^-1。農桿菌介導寒富蘋果轉化體系的建立以MS+TDz 2.0mg·L^-1+NAA 0.5mg·L^-1培養基為葉片離體再生芽培養基。適宜的轉化條件為：菌液濃度D_600nm=0.5、葉片外植體在菌液浸泡8min、共培養時間為3～4d、推遲4d進行篩選培養。抗性基因對轉化效率具有明顯的影響，EHA105(pCAMBIA2301)的平均抗性芽再生率(0.96％)比EHA105(pCAMBIA1301)的平均抗性芽再生率(0.58％)高出幾乎50％，EHA105(DcAMBIA2301)的抗性芽再生率最高達1.87％。Gus組織化學染色和PcR鑒定結果表明本研究獲得了寒富蘋果轉基因植株。

關鍵詞：蘋果；寒富；農桿菌；抗性基因；遺傳轉化

中圖分類號：S661.1 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2010)02-174-05

遺傳轉化是植物品種改良和基因功能驗證的重要途徑。遺傳轉化克服了傳統雜交育種存在的周期長、費用高、基因資源缺乏等問題，實現了定向育種等目標，給植物品種改良展現出美好的前景，并已在一些植物育種中發揮了重要的作用。此外，遺傳轉化也是檢驗克隆基因功能的有力手段，通過過量表達或基因沉默策略來研究基因功能，可以準確地分析鑒定克隆的基因在植物器官發育、衰老和生理代謝中的作用及調控機制。

1989年James等首次利用農桿菌介導的轉化方法獲得了綠袖蘋果轉基因植株，隨后國內外學者相繼獲得了元帥、皇家嘎拉和新喬納金等蘋果品種的轉基因植株。但是，獲得蘋果轉基因植株至今仍然比較困難，主要原因是蘋果離體再生能力較差，轉化體系不夠完善，遺傳轉化效率不高(一般都在1％以下)，而且能夠獲得轉基因植株的蘋果基因型數量寥寥無幾，這些都阻礙了轉基因技術在蘋果上的應用。

寒富(Malus domestica cv．Hanfu)是沈陽農業大學育成的蘋果品種，具有耐旱、抗寒、抗病蟲害、大果、豐產等優點，尤為適合冷涼地區栽培。高效的離體再生體系是遺傳轉化的基礎，歐春青等發現寒富葉片具有極強并且穩定的離體再生能力。我們對影響寒富轉化效率的因素進行系統研究，旨在建立寒富高效、穩定的農桿菌介導的遺傳轉化體系，為進一步開展蘋果基因功能驗證和寒富蘋果基因工程改良奠定基礎。

1 材料和方法

1．1 植物材料

寒富蘋果試管苗由沈陽農業大學果樹細胞工程實驗室保存。取生長在繼代培養基(MS+0.3mg·L^-16-BA+0.2mg·L^-1IAA+0.1mg·L^-1GA³)培養約30d的試管苗頂部展開葉片，剪去葉尖和葉柄部分，將中間部位剪成3～4mm寬的葉塊，作為轉化的外植體。

1．2 菌株和載體

所用菌株分別為EHA105(pCAMBIA1301)和EHA105(pCAMBIA2301)。pCAMBIA1301含潮霉素(Hygromycin，Hyg)抗性基因，pCAMBIA2301含卡那霉素(Kanamyein，Kan)抗性基因，2種載體均攜帶含內含子的GUS報告基因。pCAMBIA2301載體由中國農業科學院生物技術研究所吳燕民研究員惠贈。

1．3 抗生素濃度的篩選

將外植體接種到添加不同的Hyg(0、3、4、5、6、7mg·L^-1)或Kan(0、5、15、25、35、45mg·L^-1)的再生培養基(MS+TDZ2.0mg·L^-1+NAA 0.5mg·L^-1)上進行培養，5周后觀察外植體的生長和再生情況。

1．4 農桿菌菌液制備

分別從固體YEP培養基(蛋白胨10g·L^-1+酵母提取物10g·L^-1+NaC15g·L^-1，瓊脂粉15g·L^-1，pH7.0)上挑取上述含不同質粒的EHA105農桿菌單菌落。置于附加Kan 50 ing·L^-1及Rif100mg·L^-1的YEP液體培養基中28℃、200r·min^-1振蕩培養至D_600nm為0.8；取適量菌液于新的YEP液體培養基中繼續振蕩培養至D_600nm為0.4～0.5；22℃、5000r，min^-1離心5min收集菌體；用MS液體培養基懸浮備用。

1．5 侵染及抗性芽篩選

將剪好的葉塊置于懸浮好的菌液中，輕搖4～16min后取出，置于無菌濾紙上吸干多余菌液，轉至再生培養基上，在黑暗條件下共培養2～5d，然后將外植體轉至在附加200mg·L^-1頭孢噻肟鈉(Cefo-taxime，Cef)的再生培養基中推遲篩選2～8d。推遲篩選后的外植體轉至附加250mg，L^-1Cef、25mg·L^-1Kan或4mg·L^-1Hyg的再生培養基中進行抗性芽篩選。待抗性芽再生出后，將抗性芽轉移至新的附加250mg·L^-1Cef、25mg·L^-1Kan或4mg·L^-1Hyg的增殖培養基(MS+2.0mg·L^-16-BA+0.2mg·L^-1NAA)中培養。

1．6 GUS基因PCR檢測

用CTAB法提取植物基因組DNA，擴增引物為：5’TCGTCCGTCCTGTAGAAA一3’和5’-ATG-GTATCGGTGTGAGCG-3’，PCR反應體積為20μL，反應參數為：95℃預變性1min，然后95℃變性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，共35個循環，最后72℃延伸10min。以質粒為陽性對照，未轉化的寒富為陰性對照。

1．7 GUS表達檢測

采用組織化學染色法檢測GUS基因表達，檢測緩沖液成分包括25mmol·L^-1磷酸鹽緩沖液(DH7.0)、0.5mmol·L^-1鐵氰化鉀、0.5mmol·L^-1亞鐵氰化鉀、10mmol·L^-1EDTA、0.1％Triton-X100、0.5g·L^-1X-gluc。將待檢測材料置于檢測液中，于37℃黑暗下保溫24h，然后經FAA溶液固定，70％乙醇脫色后觀察染色情況。

1．8 數據調查與統計分析

葉片外植體在附加篩選壓的再生培養基中培養35d后調查分化芽數并計算分化率：

分化率(％)=出芽的外植體數，接種外植體數×1OO

經農桿菌侵染之后的葉片外植體在附加篩選壓的再生培養基中培養42d后調查抗性芽再生率：

抗性芽再生率(％)=抗性芽數／接種外植體數×100

顯著性分析用DPS軟件處理。

2 結果與分析

2．1 抗生素種類和濃度對寒富葉片再生不定芽的影響

未經侵染的葉片離體再生芽的分化對Hyg較為敏感，當Hyg質量濃度為4mg·L^-1時，就能有效地抑制不定芽的發生，并常常會導致外植體發生褐化現象，且較為嚴重。當Kan質量濃度為25mg·L^-1時，沒有再生芽出現(表1)，少量外植體出現白化現象。因此，對于寒富蘋果的遺傳轉化，以Hyg為篩選壓時，適宜的質量濃度為4mg·L^-1，而以Kan為篩選壓時，適宜的質量濃度為25mg·L^-1。

2．2 推遲篩選時間對轉化率的影響

推遲篩選時間對寒富轉化率的影響較大，由表2可見，當推遲篩選4d時，含2種不同質粒的EHA105農桿菌抗性芽再生率都較高，分別為0.85％的EHA105(pCAMBIA1301)和1.16％的E-HA105(pCAMBIA2301)；不進行推遲篩選，未能再生出抗性芽；推遲篩選2d時，菌株EHA105(pCAMBIA41301)侵染的葉片未能再生出抗性芽，而菌株EHA105(pCAMBIA2301)侵染葉片的抗性芽再生率也較低；推遲篩選6d時，開始出現逃逸芽，而且逃逸芽在數量上遠遠超過抗性芽，轉化效率低；推遲篩選8d時，非轉化細胞生長過旺，抑制轉化細胞生長，并且抗生素對非轉化細胞難于抑制，雖然再生芽數量較多，但是全部是逃逸芽。

2．3 共培養時間對轉化效率的影響

侵染后的外植體如果不進行共培養，農桿菌不易侵入，無法完成轉化過程，沒有獲得抗性芽(表3)。當外植體和農桿菌共培養3～4d時抗性芽再生率較高，其中葉片與EHA105(pCAMBIA2301)共培養4d處理的抗性芽再生率達到1.87％(表3)。當共培養5d時，外植體周圍可見明顯的農桿菌菌落，切口處農桿菌最多，外植體損傷較重，死亡數較高，抗性芽再生率為0。

2．4 菌液濃度和外植體在菌液中浸泡時間對轉化效率的影響

農桿菌菌液濃度的高低對于轉化效率影響較大，由表4可知，當D_600nm值為0.5時轉化效果最好，2種不同質粒的農桿菌差別不大。當菌液濃度超過1.0時，對外植體損傷較大，外植體切口部位褐化現象嚴重，轉化效率顯著下降。菌液濃度少于0.1時，菌體數量較少，轉化效果不理想，2種菌株的抗性芽再生率都為0。

外植體在菌液中浸泡時間試驗設置了4個處理。結果表明(表5)，在浸泡時間為8min時，寒富外植體抗性芽再生率最高，EHA105(pCAMBIA1301)和EHA105(pCAMBIA2301)侵染后的抗性芽再生率分別為0.95％和1.55％。浸泡時間超過12min時，外植體損傷較重，抗性芽再生率顯著下降。當浸泡16min時，外植體損傷嚴重，抗性芽再生率為0。

2．5 抗性基因對轉化效率的影響

選擇不同的抗性基因直接影響寒富蘋果的轉化效率。由以上結果(表2～5)可以總結出，選用含抗Kan基因的農桿菌EHA105(pCAMBIA2301)所獲得的抗性芽數明顯高于含抗Hyg基因的農桿菌EHA105(pCAMBIA1301)所獲得的抗性芽數，并且EHA105(pCAMBIA2301)的最高和平均的抗性芽再生率分別是1.87％和0.96％，而EHA105(pCAM-BIA1301)的最高和平均的抗性芽再生率分別是1.13％和0.58％。

2．6 轉基因植株的組織化學染色鑒定和PCR鑒定

隨機挑取抗性芽進行GUS組織化學染色鑒定，結果表明抗性芽呈GUS染色陽性(圖版—D)。抗性芽(圖版—A，B)在附加選擇壓的增殖培養基上能夠分化成植株，共獲得21個獨立的抗性植株，其中EHA105(pCAMBIA2301)侵染獲得14個抗性植株，EHA105(pCAMBIA1301)侵染獲得了7個抗性植株。隨機選擇8個抗性植株進行PCR分析，結果表明，8株抗性植株均擴增出預期大小(1400bp)的GUS基因片段(圖版—C)。取其抗性植株頂稍葉片進行GUS組織化學染色，結果葉片有明顯的藍色反應(圖版—E)，表明GUS基因可穩定表達。

3 討論

目前國內外關于蘋果轉基因研究多以皇家嘎啦作為材料，這是由于皇家嘎拉的離體再生能力較強，在已獲得轉化植株的蘋果品種中，其轉化效率是最高的，達到1.7％。但是蘋果轉化效率普遍較低仍然是國內外蘋果轉化研究所面臨的比較棘手的問題。本試驗首次選擇葉片可高效再生不定芽的寒富蘋果作為材料，通過對影響農桿菌介導的轉化效率各因素的研究，表明寒富蘋果適合用于遺傳轉化研究，轉化效率較高，抗性芽再生率可達1.87％。為了進一步提高寒富蘋果的轉化效率，還研究了附加乙酰丁香酮(AS)和聚乙二醇(PEG4000)，對寒富轉化效率的影響，但是效果不明顯。

抗性基因的不同決定了篩選抗生素種類的不同，由于植物對不同抗生素的敏感性不一樣，因此，抗性基因的選擇直接影響轉化效率。Hyg抗性基因和Kan抗性基因是最常用的抗性基因，已有的蘋果遺傳轉化研究基本上都是以Kan抗性基因為篩選基因，近幾年來蘋果遺傳轉化研究也有利用Hyg抗性基因作為篩選基因的。本研究表明，在農桿菌相同的條件下，質粒上抗性基因的不同，轉化效率明顯不同，含Kan抗性基因的菌株EHA105(pCAMBI-A2301)的轉化效率高于含Hyg抗性基因的菌株EHA105(pCAMBIA1301)。寒富葉片對Hyg反應敏感，外植體在含Hyg的培養基中培養一段時間后褐化嚴重，而且不同批次轉化試驗的轉化效率變化較大，總體上轉化效率較低。因此，對于蘋果的遺傳轉化，應選擇Kan抗性基因為選擇基因。

適宜的推遲篩選時間對抗性芽的分化是有幫助的，適宜的推遲篩選時間可以避免抗生素突然的抑制作用，從而提高抗性芽再生率。例如，Ogaki等采用14d的推遲篩選得到了大量的百合轉化芽。張志宏通過2d的推遲篩選提高了新喬納金抗性芽的誘導率。本研究發現，推遲篩選4d時，寒富抗性芽數量明顯提高。這可能是寒富基因型材料受農桿菌侵染之后需要一定時間的緩和期才能達到細胞分化高峰期，如果外植體不經推遲篩選，直接進行抗生素篩選，這就可能抑制了外植體細胞分化，無法達到細胞分化的高峰期，從而降低了轉化效率。但是，推遲篩選時間不宜過長，過長的推遲篩選時間會導致逃逸芽數的增多，不能形成抗性芽。