紅毛丹灰斑病病原菌鑒定及生物學特性研究

摘要：對紅毛丹灰斑病病原菌進行分離，鑒定病原菌為擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsi sp.)，該菌危害紅毛丹為首次報道。對病原菌進行了形態學、致病性及生物學特性的研究。結果表明，紅毛丹灰斑病菌在10～35℃下均能生長，適宜生長溫度為25～28℃，PDA和CA培養基上生長較好。病原菌在pH3～11都能生長，pH4～8生長較好，pH6生長最佳。光照對病原菌的生長有明顯促進作用，病原菌的致死溫度為60℃10min。PDA培養基中加入不同的糖對病原菌生長有不同的影響，以木糖、甘露糖、山梨糖和蔗糖最好。PDA培養基中添加2％的不同的氮源對病原菌生長的沒有明顯的促進作用。

關鍵詞：紅毛丹；灰斑病菌；生物學特性

中圖分類號：S667.99 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2010)02-270-05

紅毛丹(Nephelium lappaceum L.)是無患子科(Sapindaeeae)韶子屬(NePhelium)果樹，原產馬來西亞群島。1930-1960年間先后引入我國海南省和云南西雙版納等地栽培。目前我國的種植區域，集中在海南的保亭、陵水、三亞及云南的西雙版納。紅毛丹是熱帶珍稀水果，其營養價值豐富，市場上供不應求，很具發展前景。紅毛丹上有多種病害發生，國內外報道的紅毛丹病害主要有：藻斑病、葉枯病、霜霉病、炭疽病、白粉病、黑果病、莖潰瘍病、褐斑病等。

2008年5月對海南省紅毛丹病害進行調查時發現一種未見報道的新病害——紅毛丹灰斑病，該病害的發生導致葉片出現黑褐色大面積病斑，枝干表面灰白色病斑并出現凹陷狀潰瘍，對紅毛丹的生產造成一定的經濟損失。有關該病的研究未見報道，為了預防和控制紅毛丹灰斑病的發生，我們對紅毛丹灰斑病進行病原菌鑒定，并對其病原菌進行生物學特性的研究，以期為生產上防治該病害提供一定的理論基礎。

1 材料和方法

1．1 材料

2008年5月從海南省保亭縣新星農場紅毛丹種植基地采集密布黑色及灰白色斑塊的紅毛丹葉片和枝干用于病原菌分離培養。

1．2 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)；燕麥培養基(OA)；胡蘿卜培養基(CA)：胡蘿卜200g，瓊脂粉18g，葡萄糖15g，定容至1000mL；玉米粉培養基(CMA)：稱取玉米粉200g，加水煮沸20min，四層紗布過濾，加入瓊脂粉18g，定容至1000mL；查氏(Czapek)培養基；水瓊脂培養基。

1．3 病原菌的鑒定

病原菌的分離培養采用常規的組織分離法，28℃，PDA培養基平板上培養，2d后及時挑取菌種進行純化，經單孢分離后保存在PDA培養基試管斜面上。

7d后鏡檢觀察菌絲、孢子的形態，并進行病原菌鑒定。

用菌絲塊或分生孢子懸浮液接種健康的紅毛丹葉片，28℃保濕培養，觀察發病情況并再分離病原菌。

1．4 病原菌生物學特性的測定

1．4．1 培養基對菌絲生長的影響 分別用打孔器打取直徑為7mm的菌絲塊接種于PDA、CA、OA、CMA、Czapek和水瓊脂平板中央，且菌絲面朝下，放置在28℃生化培養箱中培養。5d后用十字交叉法測量菌落直徑，每處理4次重復(下同)。用SAS法進行方差分析(下同)。

1．4．2 溫度對菌絲生長的影響 將菌餅接至PDA培養基中央，分別在5，10，20，25，28，35，40℃的恒溫條件下培養5d，觀察菌絲生長情況，每天用十字交叉法測量菌落直徑的大小。

1．4．3 pH值對菌絲生長的影響 用1mol·L^-1NaOH和1mol·L^-1HCl溶液調節滅菌的PDA培養基，制成pH分別為3，4，5，6，7，8，9，10，11共9種不同pH的PDA培養基，倒平皿后，將菌餅移至平板中央，在28℃恒溫下培養，用十字交叉法每天測量菌落直徑的大小，連續測量4d。求其平均生長速率。生長速率(cm·d^-1)=(菌落直徑一菌餅直徑)/T(T為第T天)。

1．4．4 光照對菌絲生長的影響 設置全光照、12h光暗交替、完全黑暗3種光照條件，用PDA培養基，接菌后28℃培養，培養至第5天用十字交叉法測量菌落直徑。

1．4．5 不同碳源對菌絲生長的影響 PDA培養基是以ω(葡萄糖)=0.02作為碳源。分別以相同含純碳量的蔗糖、麥芽糖、乳糖、果糖、半乳糖、可溶性淀粉、山梨糖、甘露糖、鼠李糖、木糖取代基礎培養基PDA中的葡萄糖，配制成相同含碳量不同碳源的培養基，經高壓滅菌后接種，以不加碳源作為對照，每處理重復4次。28℃培養，培養至第5天用十字交叉法測量菌落直徑。

1．4．6 不同氮源對菌絲生長的影響 分別加入與2％的氨基乙酸純含氮量相同的丙氨酸、胱氨酸、酪氨酸、亮氨酸、甘氨酸、胰-蛋白胨、酵母浸膏、硝酸鈉、硫酸銨、氯化銨10種氮源制成添加不同外源氮的PDA培養基，以不加氮源作為對照，每處理4次重復。接菌后28℃培養，培養至第5天用十字交叉法測量菌落直徑。

1．4．7 致死溫度測定在 PDA培養基上活化培養5d的病原菌，加無菌水用滅菌三角玻璃棒刮取菌絲體，然后用滅菌雙層拭鏡紙過濾，配成菌絲及分生孢子懸浮液。取滅菌具塞玻璃試管，分別置于40，45，50，55，60，65℃恒溫水浴鍋中，當試管內溫度達到設定溫度時，加入2mL孢子懸浮液，水浴10min，一支試管在室溫中放置作為對照，每處理重復3次。然后各取0.2mL經過處理的孢子懸浮液涂在PDA培養基上，28℃培養。48h后觀察有無菌落出現。

1．5 統計分析

采用SAS8.02數據分析軟件進行Duncan氏新復極差法。

2 結果與分析

2．1 病原菌鑒定

2．1．1 癥狀 病斑橢圓形或不規則形，黃灰色，邊緣深褐色，直徑可達2～3cm，子實體散生或呈輪紋狀排列。分生孢子盤多發生于葉片變色壞死的部分，不規則，兩面生，黑色，散生或聚生(圖版-A)。

2．1．2 病原菌的形態 PDA培養基上，菌落灰白色，圓形，菌落表面呈有層次的波浪形，后期中央出現銀灰色孢子堆，菌絲糾集成棉絮團狀，子實體較小，比較堅硬，鑲嵌于培養基中，菌落背面黑色(圖版-B)。

分生孢子5細胞，分隔處不縊縮，直或略彎曲，紡錘形，分生孢子大小10.60～14.66(12.77)×2.91～3.79(3.46)μm，中間3個細胞同為褐色，色胞長8.07～10.44(9.35)μm；頂細胞與基部細胞無色，圓錐狀，具有2～3根附屬絲，無色，長12.25～16.18(14.07)μm；基部細胞末端漸尖(圖版-C)。根據分生孢子的形態特征鑒定該病原菌為Pestalotiopsis sp，屬半知菌類，腔孢綱，黑盤孢目，黑盤孢科，擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis。

2．1．3 致病性測定 室內接種的新鮮葉片置于28℃下保濕培養，5d后接種部位出現明顯黑褐色病斑，病斑早期周圍有黃色暈圈。從發病葉片上可重新分離得到該病原菌，重新分離得到的病原菌的培養性狀、分生孢子形態和大小，均與當初接種的病原相同。證實Pestalotiopsis sp.為致病菌。

2．2 病原菌的生物學特性

2．2．1 培養基對菌絲生長的影響 病菌在供試的6種培養基上都能生長，在CA和PDA培養基上生長最好，菌落生長快，氣生菌絲豐富，且產孢量大；CZ和OA培養基次之；在CAM和水瓊脂培養基上生長較差，雖然菌落生長較快，但氣生菌絲較少或稀疏，產孢少。

2．2．2 溫度對菌絲生長的影響 病菌菌絲生長溫度為10～35℃，其中最適生長是25～28℃，最適溫度為28℃，5d菌落直徑為6.58cm，其次是25℃，菌落直徑為6.05cm，20℃和10℃下菌落直徑分別為5.40cm和5.10cm。35℃時菌絲生長勢較差，5d菌落直徑僅為0.95cm，溫度低于5℃或高于40℃病原菌在PDA上不能生長(表2)。

2．2．3 不同pH對菌絲生長的影響 病原菌在pH值3～11的PDA培養基上均能生長(圖1)，適宜生長的pH值為4～8，最適生長pH值是6，培養4d平均生長速率為1.41cm。說明該菌在中性或偏酸性的環境條件下適合生長。

2．2．4 光照對菌絲生長的影響 有光照的條件更適合菌絲生長，全光照菌絲生長速度最快，培養5d菌落平均直徑為5.63cm。全光照與光暗交替條件下的菌落直徑4.28cm差異不顯著，但2者與完全黑暗條件下生長的菌落直徑2.30cm存在顯著性差異。

2．2．5 不同碳源對菌絲生長的影響 病菌在外加不同供試碳源的PDA培養基上均能生長(圖2)，其中在外加木糖、甘露糖、山梨糖和蔗糖4種外加碳源的培養基上生長較好，其次是乳糖和半乳糖，而在麥芽糖和鼠李糖的培養基上生長最差。說明該菌株的生長對碳源的要求較高。

2．2．6 不同氮源對菌絲生長的影響 PDA培養基中外加不同的氮源對病原菌的生長促進作用不明顯(圖3)，除丙氨酸和甘氨酸對病原菌的生長有促進作用外，其余外加氮源對病原菌的生長無促進作用，胱氨酸、胰-蛋白胨和硫酸銨對病原菌的生長有抑制作用。

2．2．7 致死溫度測定 Pestalotiopsis sp，菌絲經50℃、55℃水浴處理10min，有部分菌絲可繼續生長，60℃下處理10min后菌絲完全停止生長，說明病原菌菌絲的致死溫度為60℃處理10min。

3 討論

紅毛丹作為一種熱帶水果，國內種植面積較小，僅在海南省保亭等地和云南西雙版納部分地區有種植，再加上種植條件極其苛刻以及多種病害的影響，因而在國內就更使其身價倍增。在國內紅毛丹病害方面的研究報道很少，目前在病害方面對其研究主要集中在果實病害上，海南保亭地區發現黑果病，西雙版納地區危害紅毛丹的病害主要為果實酸腐病和霜霉病等。但對上述病害的病原生物學特性、發病規律及防治措施等方面的研究未見報道。

擬盤多毛孢屬可寄生超過50個科的植物，植物受害后表現為葉斑、腐爛、潰瘍等癥狀，嚴重影響產品的質量和品質。多種擬盤多毛孢在我國引起嚴重的植物病害，戚佩坤和楊秀娟等對枇杷葉斑病菌擬盤多毛孢[Pestalotiopsis eriobotryfolia(Guba)Chen et Chao]的形態學、生物學特性進行了研究。葛起新等報道了山茶灰斑病的病原菌是斑污擬盤多毛孢Pestdotiopsis DzaclzZans(Cda.)Nag Rai。國內外目前尚未見擬盤多毛孢屬侵染紅毛丹的報道。

擬盤多毛孢菌的分類一直以來主要是根據分生孢子的形態特征和寄主來劃分，而該病菌沒有明顯的寄主專一性，擬盤多毛孢屬真菌在不同的生長環境條件下生長狀況有所不同，分生孢子形態表現出很大的差異。至今，全世界已報道Pestalotiopsis有241種，大多數是以寄主植物為依據定種。但Hawksworth指出擬盤多毛孢屬真菌實際的種類應為50種左右。形態特征與分子特征相結合進行種的確認和命名是當前和今后擬盤多毛孢屬分類和鑒定的趨勢舊。

研究首次對紅毛丹灰斑病的病原菌進行鑒定及病原菌的生物學特性進行研究。病原菌的鑒定只局限在形態特征方面展開的研究，為了進一步明確紅毛丹灰斑病病原菌種的分類地位，還待分子實驗來加以準確認定，這對于擬盤多毛孢的多樣性研究及其所致病害的寄主范圍的確定有著重要的理論和實用價值。

4 結論

經病原菌分離和接種試驗，證實海南省紅毛丹灰斑病為擬盤多毛孢菌(Pestcdotiopsis sp.)。對灰斑病菌的生物學特性研究結果表明，病菌在PDA和CA培養基上生長最快，氣生菌絲豐富，且產孢量多，該病菌對環境條件的適應范圍較廣。病菌對碳源的要求較高，在木糖和甘露糖的碳源培養基上生長最好，而在麥芽糖和鼠李糖的培養基上生長較差；氮源培養基以丙氨酸和甘氨酸生長最好，而胱氨酸、胰一蛋白胨和硫酸銨對病原菌的生長有抑制作用。病原菌在有光條件下生長比無光好，菌絲的致死溫度為60℃。(本文圖版見封3)