板栗野生居群遺傳多樣性研究

摘要：使用從板栗中提取的10個微衛星引物對4個中國栗野生居群的69個個體進行擴增，共檢測到84個等位基因，每個位點的等位基因數為4～13，每位點的平均等位基因數目為8.4個，平均有效等位基因數(N_e)為4.998，平均期望雜合度(H_e)為0.777，平均PIC值為0.739，Nei’s多樣性指數(h)為0.771，以陜西漢中居群具有最高的遺傳多樣性。遺傳分化系數G_st僅為0.141。UPGMA樹狀聚類圖表明4個野生群體被分為兩部分，其中云南、四川、安徽3個居群距離相近位于同一組，此結果與PCA分析結果一致，2種方法均顯示居群間的遺傳關系與實際地理分布不完全相關。

關鍵詞：野生板栗；微衛星；遺傳多樣性

中圖分類號：S664.2 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2010)02-227-06

板栗(Castanea，mollissima Blume)是我國栽培最早的果樹之一，目前在22個省市中都有栽培。而作為栽培栗的野生資源，野生板栗主要分布在秦嶺南坡、大巴山、云貴高原以及大別山地區，是我國板栗栽培品種遺傳改良的重要野生資源。近些年，隨著板栗商業化栽培向野生板栗分布地的快速擴張，野生板栗林面積逐年大幅減少，在一些野生板栗分布地，只有零星分布。盡管對于野生板栗的研究較早，對于與板栗野生種質資源保護密切相關的遺傳多樣性、遺傳結構仍缺乏了解。

微衛星(microsatellite)，也稱簡單重復序列(sim-ple sequence repeat，SSR)，廣泛存在于真核基因組中。作為共顯性分子標記，SSR因具有多態性高，實驗操作簡單、穩定重復性好，DNA用量少等優點，目前已廣泛應用于基因型分析、遺傳圖譜構建、基因定位等領域。

作者利用SSR分子標記技術對天然野生板栗4個居群的遺傳多樣性和遺傳結構進行研究，以期為今后板栗野生資源的保護以及可持續利用提供參考。

1 材料和方法

1．1 材料

野生板栗樣本采自我國陜西、長江流域及西南地區天然野生板栗分布區域(表1)，每個居群選3～5個調查點，分別相距30km以上，每個調查點隨機選取3～5株栗樹，每株分別采集樹冠外圍一年生健康枝條，對樣本進行登記，通過嫁接、實驗室水培等方式，獲取幼嫩新鮮葉片為試驗材料。

將萌發的幼嫩葉片用蒸餾水沖洗干凈，在濾紙上吸干水分，用液氮速凍后，放人-80℃的低溫冰箱中保存。

1．2 方法

1．2．1 DNA的純化 采用CTAB法提取高質量的基因組DNA。在1％瓊脂糖凝膠電泳(北京六一儀器廠，DYY-Ⅲ型)檢測DNA的完整性，用紫外分光光度計(Eppendoff Biophotometer6131)測定DNA的濃度和純度。

1．2．2 微衛星的擴增 表2列出了試驗涉及的微衛星位點和引物，其中引物1和2為本實驗室開發，引物3～10從艾呈祥等開發的引物中選出。SSR擴增在Biometra公司的T1 Theromcycler PCR儀上進行。25μL反應體系含有：10mmol·L^-1Tris-HCl(DH8.3)，1.5mmol·L^-1。MgCl₂，0.2mmol·L^-1dNTPs，0.2mmol·L^-1引物，1.0U Taq DNA聚合酶，50～100ng的模板DNA(上述藥品均來自華美生物T程公司)。擴增程序為：94℃預變性3min，94℃變性30s，51～56℃復性40s，72℃延伸40s，共40個循環，最后在72℃延伸8min。

擴增產物用6％聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，60W電泳2.5h，銀染染色。

1．2．3 數據處理與分析 用Cervus2.0軟件計算位點的預期雜合度(Expected heterozygousity H.)、觀測雜合度(Obsmved heterozygosity H。)、多態信息含量(Polymorphism Information Content PIC)，其中多態信息含量(PIC)：

PIC=∑f_i²式中：f_i代表第i個等位基因出現的頻率。GenAlEx軟件計算居群的遺傳多樣性(H_s)、基因分化系數(G_st)、多樣性指數(I)、基因流(N_m)、以及分子方差(AMOVA)和主坐標分析(Principal CoordinatesAnalysis PCA)。TFPGA軟件進行UPGMA聚類分析并繪制樹狀圖。

2 結果與分析

2．1 微衛星位點的多態性

10對微衛星引物成功地從野生板栗4個居群的69個個體中擴增出PCR產物，共擴增出84個等位基因，平均每位點的等位基因數目為8.4個，不同位點的等位基因數量差異較大，其中URTM010809位點等位變異最多，為13個，最少的是CmTCR 15位點，僅為4個。9個位點的H_o在0.074～0.29，表現出較低的雜合性(H_o＜0.5)(表3)。10個位點的P/C值在0.616～0.885，平均PIC值為0.739，顯示了我國野生板栗遺傳背景的復雜性和多樣性，而位點的H_s值也表明位點遺傳多樣性水平高。從表3中還可看出，各位點的G_st值有較大差異，變化為0.041～0.331.平均為0.141，即有14.1％的遺傳變異存在于居群之間，絕大部分變異(85.9％)存在于居群內。

2．2 群體遺傳多樣性

在4個板栗野生居群中，有效等位基因數在2.7～3.76，平均值為3.29，其中以四川城口N_e=3.76最高，安徽廣德最低。Nei′s基因多樣性指數(H_s)顯示4個各居群的遺傳變異由高到低依次是漢中>城口＞昭通＞廣德，可見陜西秦嶺地區天然野生板栗群體內蘊含較為豐富的變異(表4)。

2．3 居群遺傳變異分析

為了確定板栗天然野生群體微衛星位點的變異總量及在群體間和群體內的分布，對群體變異進行了等級分析。采用分子變異層次分析(AMOVA)進行的基于歐氏距離平方的遺傳變異巢式方差分析結果表明，天然野生板栗的遺傳變異主要存在于居群內，占總變量的87％，居群間的遺傳變異為13％(P＜0.01)(表5)，該結果與由G_st值得到的結果相一致(表3)。此外，野生板栗群體的N_m值為2.476，也表明居群間存在著較為頻繁的基因交流，從而減小了因遺傳漂變引起的居群間分化。

2．4 板栗野生居群的PCA分析和聚類分析

本研究中PCA(Prineipal Coordinates Analysis)對4個野生板栗居群的分析顯示居群的個體差異(圖1)。在二維散點圖中，4個居群的全部個體呈現出了寬廣、均勻分布的特征，表明它們的遺傳背景廣泛且基因型分布均勻。然而，4個居群的69個樣本明顯地被分為2組，陜西漢中居群的28植株明顯地與其他3個居群相分離，說明該群體與其他群體之間的基因交流較少，親緣關系較遠，具有其相對獨立的演化過程；而四川城口、云南昭通、安徽廣德居群的41個個體間相互交錯重疊，呈均質化，表明3個群體間的遺傳結構相似，沒有明顯的結構分化。

基于UPGMA聚類分析結果，4個居群被分為2個類群(圖2)。第一組中，西南地區的四川城口與云南昭通2居群遺傳距離最近，關系最為密切，而后與長江中下游流域安徽居群聚在一起，最后才與西北的陜西漢中群體聚在一起，該結果與通過PCA方法獲得的結果相一致。此外，2種方法的聚類結果還表明居群間的遺傳關系與居群的實際地理分布不完全一致。

3 討論

本研究中使用的10對微衛星引物均能從4板栗野生居群的全部樣品中擴增出清晰、重復性好的有效片段，位點擁有等位基因數量明顯高于同工酶，而相對于RAPD標記，其共顯性的特性使其在研究板栗野生資源遺傳多樣性和居群遺傳結構方面具有更大的優勢。

多態信息含量(P/C)是表示微衛星位點變異程度高低的一個指標。當PIC＞0.5時該位點為高度多態性；當0.25＜PIC＜0.5時，為中度多態性位點；當PIC＜0.25時，為低度多態性位點。本研究中，10個微衛星位點對4個天然板栗居群69個樣本進行SSR遺傳分析，PIC值平均為0.739，Nei(h)平均值為0.771，2者都顯示野生板栗的遺傳多樣度水平較高。與同屬的姊妹種日本栗、歐洲栗、美洲栗相比較，野生板栗的遺傳變異水平是最高的，甚至高于中國特有種錐栗和茅栗。就分布區域而言，尤以陜西居群的各項多樣性指標均高于其他群體，顯示了該區域野生板栗群體具有很高的多樣性。由于此前對板栗遺傳多樣性的研究全部集中于地方品種群，板栗遺傳多樣性中心的確定仍需作進一步的探討。Hamrick等認為以異交為主的物種，90％的遺傳變異發生在居群內部。而本項研究顯示野生板栗的基因分化系數為0.141，居群間呈中度分化，這表明由于地理和生境變化，野生板栗居群間已經產生一定程度的分化，但群體遺傳變異的大部分仍然來自居群內部。AMOVA分析也表明僅13％的遺傳變異發生在居群間，而87％的遺傳變異存在于居群內，與上述結論一致。遺傳結構的形成較為復雜，不僅與地形因子、氣候等形成有一定適應變化趨勢，也與非選擇因素有關。因此，基礎株效應、Walhud效應、分布區內生境多樣性和人工栽培歷史等因素，均對產生和保存板栗群體遺傳結構變異模式起到了重要作用。我國野生板栗分布區地處偏僻，且板栗品種化栽培開展較晚田，其中秦嶺南坡，社會經濟條件較為落后，野生板栗生境的人為破壞較少；加之當地地形復雜，交通閉塞，天然地理隔離(秦嶺一漢水一大巴山)明顯，使其與外界缺乏基因交流，得以保存較高的多樣性。而大別山地區，因板栗品種化栽培較早及近些年林業資源的大規模開發，野生板栗資源大量消失，目前已經很難見到成片存在的野生板栗林，其基因豐富度明顯不及秦嶺地區。

Wright認為當群體的N_mm值為2.476，表明野板栗居群間存在著一定程度的基因交流。結合PCA分析結果，這種頻繁的遺傳物質交換應主要發生在秦嶺居群外的其他3個居群間。板栗天然居群主要靠種子實生繁殖，鑒于頑拗性種子的生理特點，板栗種子應不具備長距離傳播能力，而嚙齒類動物或鳥類僅能在一定距離內為其種子的擴散提供幫助。因此，目前3個居群間的這種復雜的遺傳關系可能源于居群演化初期存在的多態性以及漸滲雜交，在對重慶東南部、貴州、廣西及湖北的板栗野生居群進行研究后，或許能夠得到較為清晰的解釋。

基因分化系數只是對一個群體分化程度的評價，而遺傳一致度和無偏遺傳距離的度量則可表明居群間體間彼此關系的親疏。UPGMA聚類分析表明4個野生板栗居群的地理分布和遺傳多樣性分布沒有直接的相關性，而基于多態條帶表型的主座標分析(PCA)所給出的二維散點圖則更為直觀地顯示了陜西秦嶺地區野生板栗與云南、四川、安徽3個居群間具有明顯差異，且在特定生境下已然形成了較為獨立的遺傳結構，而其他3個居群間的個體關系密切，與UPGMA聚類結果相同。此外，相對于野生板栗在地理和親緣關系間的差異，板栗地方品種的親緣關系與原產地之間呈一定相關性。我國現有板栗地方品種幾乎全部來源于實生選種，然而本項研究顯示板栗天然與栽培群體似乎遵循著不同的演化路線，2者之間的遺傳關系有待進一步的研究。