香蕉對(duì)甘露糖和木糖的敏感性研究

摘要：以香蕉低代試管苗莖段薄層切片和香蕉吸芽薄層切片為外植體，分別設(shè)計(jì)了13個(gè)梯度，研究了香蕉在芽的再生和愈傷組織的誘導(dǎo)階段對(duì)正篩選劑D-甘露糖和D-木糖的敏感性，為建立香蕉正篩選系統(tǒng)的遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明，(1)香蕉對(duì)D-木糖敏感，在D-木糖與蔗糖比例達(dá)到10:20時(shí)，10d開始顯示出毒性，在D-木糖與蔗糖比例達(dá)到16:14時(shí)能顯著抑制香蕉芽的再生和愈傷組織的生長(zhǎng)，當(dāng)比例達(dá)到25:5時(shí)完全抑制香蕉組織的生長(zhǎng)，香蕉組織徹底死亡。因此，D-木糖能作為有效篩選劑對(duì)香蕉進(jìn)行目的基因遺傳轉(zhuǎn)化；(2)香蕉對(duì)D-甘露糖不敏感，不適用于以D-甘露糖為篩選劑的遺傳轉(zhuǎn)化。

關(guān)鍵詞：香蕉；基因轉(zhuǎn)化；篩選劑；D-甘露糖；D-木糖

中圖分類號(hào)：S668.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1009-9980(201O)02-233-05

香蕉是熱帶、亞熱帶地區(qū)發(fā)展中國(guó)家一種果糧兼?zhèn)涞闹匾?jīng)濟(jì)作物，也是作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)口服疫苗的理想材料。香蕉主要栽培品種多為三倍體，高度不育，傳統(tǒng)雜交育種方法難以進(jìn)行品種改良，長(zhǎng)期以來(lái)，突變育種在全球香蕉新品種培育中占據(jù)了重要地位，因此，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)香蕉進(jìn)行遺傳改良就顯得尤為重要。同時(shí)，作為果糧兼?zhèn)涞闹匾秤眯越?jīng)濟(jì)作物，香蕉遺傳轉(zhuǎn)化的安全性問(wèn)題應(yīng)倍受關(guān)注。轉(zhuǎn)基因植物中的除草劑或抗生素抗性標(biāo)記基因的生態(tài)環(huán)境和食用安全性一直頗有爭(zhēng)議，目前以代謝關(guān)鍵酶基因，如糖類分解代謝酶基因(xylA和pmi基因)，作為轉(zhuǎn)基因植物選擇標(biāo)記的正篩選系統(tǒng)是解決轉(zhuǎn)基因植物安全性問(wèn)題最有效的途徑，顯示了巨大應(yīng)用潛力。但是不同植物對(duì)不同正篩選劑的敏感性有著很大的差異，有效的篩選濃度也有很大的差異，并不是所有的植物都適用于D-甘露糖或D-木糖的選擇系統(tǒng)，只有被研究的植物對(duì)它們敏感的才能選擇為正篩選劑，因此，正篩選系統(tǒng)的建立首先應(yīng)進(jìn)行敏感性測(cè)驗(yàn)。以香蕉低代試管苗莖段薄層切片和香蕉吸芽薄層切片為外植體，分別研究了香蕉在芽再生和愈傷組織誘導(dǎo)階段對(duì)正篩選劑D-甘露糖和D-木糖的敏感性，以期為建立香蕉正篩選系統(tǒng)的遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 材料

4-6代巴西蕉(Musa paradisiaca)無(wú)菌增殖芽苗，巴西蕉吸芽。D-甘露糖和D-木糖為北京拜爾迪生物公司產(chǎn)品。

1．2 方法

1．2．1 芽再生對(duì)D-甘露糖和D-木糖的敏感性 取4-6代巴西蕉無(wú)菌增殖芽苗操作，中下部莖段切成3-4mm薄片，接到添加不同濃度梯度D-甘露糖或D-木糖的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(改良MS+5 mg·L^-16-BA+0.5mg·L^-1NAA)上，暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28～30℃。芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上蔗糖與D-甘露糖或D-木糖的總糖質(zhì)量濃度為30g·L^-1，D-甘露糖及D-木糖質(zhì)量濃度梯度都為：0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、25、30g·L^-1。每個(gè)處理20個(gè)切片，3個(gè)重復(fù)。

1．2．2 愈傷誘導(dǎo)對(duì)D-甘露糖和D-木糖的敏感性選取剛出土的無(wú)病香蕉幼嫩吸芽經(jīng)表面處理后，剝?nèi)№斞壳谐珊?～2mm，長(zhǎng)寬0.5～1cm的薄片，接種到脫分化愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(改良MS+1.0mg·L^-12，4-D+0.5mg·L^-1ZT)上進(jìn)行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28～30℃。愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上蔗糖與D-甘露糖或D-木糖的總糖質(zhì)量濃度為30g·L^-1，D-甘露糖及D-木糖質(zhì)量濃度梯度都為：0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、25、30g·L^-1。每個(gè)處理20個(gè)切片，3個(gè)重復(fù)。

1．2．3 統(tǒng)計(jì)方法 出芽率％=出芽莖段數(shù)/供試莖段薄片總數(shù)×100出愈率％=誘導(dǎo)愈傷數(shù)量，供試吸芽薄片總數(shù)×100

2 結(jié)果與分析

2．1 D-木糖對(duì)香蕉組織再生的影響

2．1．1 D-木糖對(duì)香蕉芽再生的影響 D-木糖對(duì)香蕉芽分化和生長(zhǎng)影響較大(表1、圖1、圖版-A1～A13)，接種后10d觀察，A1莖段切片明顯膨大，沒(méi)有褐化現(xiàn)象，從A3開始莖段基本不膨大，褐化明顯，A12和A13莖段明顯褐死，A1～A5有萌芽現(xiàn)象，A6開始還沒(méi)有萌芽現(xiàn)象。20d觀察，A1～A7已有萌芽抽出1～2cm，A8～A11只有少量萌芽，但不抽芽。30d觀察，A12和A13莖段褐死不萌芽，A11萌少量芽，但不抽芽，A1～A10抽芽情況依次減弱，A9開始芽生長(zhǎng)情況明顯弱小。出芽率與木糖濃度的關(guān)系為：y=-3.3453x+76.293，R²=0.9741，達(dá)極顯著水平(圖1)。說(shuō)明隨木糖質(zhì)量濃度的增加，出芽率呈線性下降，當(dāng)木糖質(zhì)量濃度為22.8時(shí)，出芽率為0。

2．1．2 D-木糖對(duì)香蕉愈傷誘導(dǎo)的影響 D-木糖對(duì)香蕉愈傷的誘導(dǎo)影響較大(表1)，不但影響愈傷的生長(zhǎng)量，而且影響愈傷的誘導(dǎo)數(shù)量。接種后10d觀察，從B6開始有明顯的褐化現(xiàn)象，愈傷誘導(dǎo)明顯受影響，B12和B13的吸芽切片褐化死亡，沒(méi)有愈傷產(chǎn)生。20d觀察，從B7開始愈傷生長(zhǎng)量明顯減少，從B9開始愈傷誘導(dǎo)數(shù)量極大減少，只有部分切片產(chǎn)生愈傷，大多數(shù)切片褐化死亡。出愈率與木糖濃度的關(guān)系為：y=-3.4925x+97.281，R²=0.9546，達(dá)極顯著水平(圖2)。說(shuō)明隨木糖濃度的增加，出愈率呈線性下降，當(dāng)木糖濃度為27.9時(shí)，出愈率為0。

2．2 D-甘露糖對(duì)香蕉組織再生的影響

2．2．1 D-甘露糖對(duì)香蕉芽再生的影響 D-甘露糖對(duì)香蕉芽的分化和生長(zhǎng)影響不大(表2、圖3和圖版一C1，C5，C10，C12，C13)，接種后10d觀察，從C12開始才出現(xiàn)明顯的褐化及外植體膨大減少現(xiàn)象，C1～C11生長(zhǎng)情況基本一致。20d觀察，材料從總體上可以看出長(zhǎng)勢(shì)差異，但不如木糖明顯，從C7開始抽芽變短，約為C1～C6的1/2，出芽不如前面強(qiáng)壯。從C9開始褐化較嚴(yán)重，C12材料還有些許膨大，但C13材料基本不膨大，抽芽也非常弱小，可以看出材料在只有甘露糖的培養(yǎng)基上仍可進(jìn)行芽分化和生長(zhǎng)，但芽的生長(zhǎng)受到一定的抑制。出芽率與甘露糖濃度關(guān)系為：y=-0.2556x+60.006，R²=0.0316達(dá)不顯著水平(圖3)。說(shuō)明甘露糖質(zhì)量濃度與出芽率關(guān)系不大。

2．2．2 D-甘露糖對(duì)香蕉愈傷誘導(dǎo)的影響 D-甘露糖對(duì)香蕉愈傷誘導(dǎo)影響不大(表2、圖4、圖版-D1D13)，接種后10d和20d分別觀察，D1～D13愈傷誘導(dǎo)和生長(zhǎng)情況基本一致，愈傷誘導(dǎo)數(shù)量和生長(zhǎng)情況基本不受甘露糖的影響。

出愈率與甘露糖質(zhì)量濃度的關(guān)系為：y＝-0.014x+82.362，R²=0.0002，差異不顯著(圖4)。說(shuō)明甘露糖質(zhì)量濃度與出愈率關(guān)系不大。

3 討論

香蕉作為一種果糧兼?zhèn)涞闹匾秤眯越?jīng)濟(jì)作物，其轉(zhuǎn)基因技術(shù)的安全性問(wèn)題應(yīng)倍受關(guān)注。目前以糖代謝關(guān)鍵酶基因(如xylA和pmi基因)作為轉(zhuǎn)基因植物選擇標(biāo)記的正篩選系統(tǒng)是解決轉(zhuǎn)基因植物安全性問(wèn)題的有效途徑，可獲得比負(fù)選擇系統(tǒng)更高的轉(zhuǎn)化頻率，并且糖類代謝酶標(biāo)記基因安全、篩選劑價(jià)廉，有望成為植物轉(zhuǎn)化研究中的主導(dǎo)篩選系統(tǒng)。因此建立香蕉高效正篩選系統(tǒng)是建立香蕉高效安全轉(zhuǎn)基因技術(shù)的重要內(nèi)容，但目前還沒(méi)有文章報(bào)道正篩選體系在香蕉遺傳轉(zhuǎn)化上的應(yīng)用。

作物對(duì)篩選劑的敏感性是實(shí)際遺傳轉(zhuǎn)化中挑選篩選劑的基礎(chǔ)，本文研究了D-甘露糖和D-木糖對(duì)香蕉芽的分化和生長(zhǎng)，以及香蕉愈傷組織的誘導(dǎo)生理過(guò)程的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)香蕉對(duì)D-木糖特別敏感，當(dāng)D-木糖與蔗糖比例達(dá)到10:20時(shí)，接種10d后就明顯顯示出毒性，延遲芽的分化，并促使外植體嚴(yán)重褐化，推遲愈傷的誘導(dǎo)；當(dāng)D-木糖與蔗糖比例達(dá)到16:14時(shí)能顯著抑制香蕉芽的抽芽和愈傷組織的生長(zhǎng)，芽可以少量分化，但很難萌發(fā)抽出，個(gè)別抽出也非常弱小；當(dāng)比例達(dá)到25:5時(shí)香蕉組織的生長(zhǎng)完全被抑制，香蕉組織接種后10d已褐化死亡；因此，D-木糖是對(duì)香蕉有效的正篩選劑，建議初期篩選濃度為10g·L^-1，以后隨著組織的生長(zhǎng)而加大篩選濃度。(2)香蕉對(duì)D-甘露糖不敏感，特別對(duì)愈傷誘導(dǎo)過(guò)程幾乎沒(méi)有任何影響．當(dāng)D-甘露糖與蔗糖比例達(dá)到30:0時(shí)，愈傷誘導(dǎo)數(shù)量與生長(zhǎng)情況與0:30時(shí)根本沒(méi)有差別，愈傷誘導(dǎo)也不會(huì)因?yàn)樘砑覦-甘露糖而被延遲；D-甘露糖對(duì)芽的分化和生長(zhǎng)有一定影響，但影響較弱，接種后10d觀察，莖段切片受影響很小，當(dāng)D-甘露糖與蔗糖比例達(dá)到25:5時(shí)，莖段才出現(xiàn)較明顯的褐化現(xiàn)象和膨大減小，芽的萌動(dòng)幾乎不受影響；20d觀察，各種梯度芽的分化情況基本一致，但芽的生長(zhǎng)量D-甘露糖與蔗糖比例達(dá)到從10:20開始受到一定的抑制；30d觀察，莖段切片在D-甘露糖與蔗糖比例達(dá)到30:0仍可以進(jìn)行芽的分化和生長(zhǎng)，只是芽的生長(zhǎng)量有些減少。因此，D-甘露糖對(duì)香蕉來(lái)說(shuō)不是特別有效的正篩選劑。

王延蛟等在煙草、苜蓿及甜瓜對(duì)甘露糖耐受性比較研究中發(fā)現(xiàn)煙草和苜蓿對(duì)甘露糖不敏感，甜瓜對(duì)甘露糖敏感。這一結(jié)果也說(shuō)明并非所有的植物都適于同一種正篩選劑，需要首先通過(guò)敏感性實(shí)驗(yàn)來(lái)選擇適宜的正篩選劑再進(jìn)行正篩選系統(tǒng)遺傳轉(zhuǎn)化研究。