蘋果SRAP-PCR反應體系的建立

摘要：以蘋果(Modus domestica Borkh.)品種Telamon及Telamon×Fuji的F₁代為試材，采用改良的CTAB法提取蘋果葉片的DNA，利用正交設計L₁₆(4⁵)和直觀分析以及方差分析相結合，探討了Mg²⁺、dNTPs、Primer、Tag聚合酶、模板DNA用量對蘋果SRAP-PCR反應的影響。建立了總體積為10μL的蘋果SRAP-PCR反應體系，M²⁺濃度為2.0mmol·L^-1，dNTPs濃度為0.8mmol·L^-1，Primer濃度為0.2μmoIL^-1，Taq DNA聚合酶含量為0.6U，DNA含量為60ng，并含1μL10×buffer(Mg²⁺free)。應用該反應體系，用不同的引物組合對48份蘋果樣品DNA進行SRAP-PCR擴增，結果顯示反應體系具有較高的穩定性。

關鍵詞：蘋果；SRAP-PCR；正交分析

中圖分類號：S661.I 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2010)02-168-06

蘋果是落葉果樹中最主要的樹種，栽培面積大、分布范圍廣、產量高，在我國農業經濟中占有重要地位，也是我國在外匯出口創收方面一種重要的果樹樹種。我國是世界上蘋果生產第一大國，但在品種更新、果品質量以及參與國際市場競爭等方面又與其他先進生產國有較大的差距。要解決這個問題，根本出路在于育種，培育出適應我國不同生態條件的，有自主知識產權的新品種。現代分子標記技術的發展為解決這一問題提供了有利的手段，AFLP，SSR，RAPD等方法在蘋果分子標記輔助育種中已經得到應用。SRAP(sequence-related amDlified Dolv-morphis)是一種新型的基于PCR的標記系統，其反應體系在柑橘、荔枝、櫻桃、柿、龍眼等果樹中已經建立，張春雨等也利用SRAP對野蘋果進行了遺傳分析，但國內在栽培蘋果中應用較少。另外，有關SRAP反應體系的報道一般采用單因子試驗的方法，難免顧此失彼，忽略因子間的互作效應，我們采用正交試驗設計的方法，以Mg²⁺、dNTps、引物、模板和Taq DNA聚合酶等5個因素各4個水平，建立了蘋果的SRAP反應體系，為進一步開展蘋果的分子育種工作提供技術支持。

1 材料和方法

1．1 試驗材料

材料于2008年9月采自青島農業大學試驗園。青島農業大學園藝學院1995年以Telamon為母本，Fuji為父本進行雜交，1996年播種獲實生苗，1997年定植。建立體系所用材料為Telamon葉片。驗證建立體系所用的材料為Telamon×Fuji F，代群體中48株單株的葉片。

1．2 DNA提取與分離

用CTAB法提取材料葉片中的DNA。用瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白定量儀檢測DNA質量。-20℃保存。

1．3 SRAP-PCR擴增

反應體系為10μL。將Mg²⁺、dNTP、Primer、Taq聚合酶、DNA濃度等5種影響因素設置4個不同水平(表1)，設計L16(4⁵)正交試驗(表2)。用M5E5引物組合進行PCR擴增，重復3次以確定最優反應體系。所選引物序列如表3。PCR擴增在BIO-RADS1000 PCR儀上進行。擴增程序為：95℃、4min，95℃、45s，35℃、45s，72℃、1min，5cycles，95℃、45s，52℃、45s，72℃、1min，30cycles，72℃、5min，4℃、1h。

1．4 SRAP產物檢測

產物在8％非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，銀染檢測，用Canon EOS相機記錄。

1．5 數據統計

依擴增條帶的敏感性、特異性和清晰性即條帶強弱、雜帶的多少和背景深淺對每個處理的3個重復作1～16分計分，分數越高，表示敏感性特異性越好。若其中2者相互矛盾，則依試驗者的不同試驗目的而確定分數，并對最后確定的各個處理的分數做極差分析和方差分析，以確定最后的反應體系。

2 結果與分析

2．1 條帶分析

依據譜帶的強弱、雜帶的多少以及背景的深淺對擴增結果進行直觀分析，在16個處理組合中由于Mg²⁺、dNTPs、Primer、Taq DNA聚合酶、DNA模板等5大因素的不同，擴增效果存在著明顯的差異。從圖1中可以直觀的看出，處理4幾乎擴增不出條帶，處理1．2．3 背景很淺，擴增出的譜帶較弱，特別是細弱的條帶更弱，且擴增出的片段大小分布不均勻；處理9、10、13、14、15擴增出的譜帶很少，也比較弱；處理11、12擴增結果雖然較強但重復性不好，3次重復中均有1次擴增譜帶不理想甚至出現空白；處理5、7擴增出的譜帶雖然很強但譜帶片段大小分布不均勻，大于1000bp的片段譜帶很弱甚至沒有且背景很深；處理8雖然背景較淺但擴增出的條帶很少，主要集中在200～800bp，200bp以下的片段很弱。相比而言，處理6和處理16擴增效果比較理想，擴增出的譜帶比較強，分布較均勻，在100～1500bp都有清晰的譜帶分布，考慮到成本問題，處理6擴增效果最好。

2．2 數據統計

依據試驗結果的靈敏性、特異性及清晰度給1～16處理的3個重復打分，3個重復的平均分依次為6、8、7、1、9、16、15、13、4、5、11、12、3、2、10、14分。利用正交設計助手軟件，對試驗結果進行直觀分析，結果如表4。

極差的大小反映該因素對試驗結果的影響程度，極差越大說明該因素對試驗結果的影響越大。從表4中可以看出，在試驗水平范圍內，5個影響因子中，Mg²⁺對試驗結果影響最大，其次依次為Primer、dNTPs、TaqDNA聚合酶，DNA模板濃度影響最小。

結果均值反映了影響因素各水平對反應體系的影響情況，理論上結果均值越大說明該水平越合適，但最佳反應水平應當在實驗過程中根據實際情況來確定。

2．3 正交設計方差分析

對試驗結果進行方差分析(表5)，結果表明除模板DNA外，其他4種影響因素均對結果產生明顯影響，影響程度大小依次為Mg²⁺、Primer、dNTPs、Taq DNA聚合酶，與極差分析結果相一致，除模板DNA外，其余4種因素對試驗結果的影響為極顯著水平(P≤0.01)，可進一步進行因素內的多重比較分析。

Mg²⁺濃度對該試驗結果影響最大，多重比較分析表明，Mg²⁺濃度在2.0mmol·L^-1水平時結果均值明顯高于與其他3個水平(圖2)，這說明在該水平下最有利于SRAP-PCR擴增。

引物濃度對試驗結果的影響僅次于Mg²⁺濃度。引物濃度在0.2μmol·L^-1時，擴增效果最好(圖3)。濃度過高，非特異性帶增多，削弱了引物的鑒別能力。可見，低濃度引物適合SRAP-PCR在蘋果中的擴增。

dNTPs濃度直接影響PCR擴增，濃度過低時產生的條帶少且弱，濃度過高則會提高試驗成本。本試驗結果表明(圖4)，濃度為1.2mmol·L^-1時擴增結果最好，但根據以往經驗，濃度為0.8mmol·L^-1擴增結果也比較好，從節省成本考慮，本試驗確定最適dNTPs濃度水平為0.8mmol·L^-1。

從圖5中看出，Taq DNA polymerase量為0.2、0.4、0.6U時，結果差異不大，但根據以往經驗，酶量太少擴增結果會不穩定，重復性不好，所以本試驗確定的酶量為0.6U。

方差分析結果表明一定范圍內，DNA對擴增結果影響不顯著，本試驗根據條帶分析的結果，確定模板DNA量為60ng。

2．4 穩定性及多態性檢測

在上述試驗及分析的基礎上，本研究建立了蘋果的SRAP反應體系，即在10μL的反應體系中，Mg²⁺濃度為2.0mmol·L^-1，dNTPs濃度為0.8mmol·L^2-1，Primer濃度為0.2μmol·L^-1，Taq DNA聚合酶含量為0.6U，DNA含量為60ng，并含1μL10×buffer(Mg²⁺free)。選用ME16/EM9在Telamon×Fuii F₁代群體的48株單株中均能擴增出清晰穩定的條帶，擴增背景與特異性擴增條帶對比明顯，擴增結果穩定，基本沒有擴增模糊的現象。該體系擴增片段多集中在100～1500bp，帶型清晰穩定，無彌散(圖6)，便于進行“0”、“1”數據處理和對多態性結果進行統計分析：可以用于蘋果分子標記研究和遺傳圖譜構建研究。我們利用該體系對蘋果部分重要農藝性狀進行了標記、并構建了蘋果分子遺傳圖譜，取得了較好的應用效果(結果將另文報道)。

3 討論

SRAP標記作為一種基于PCR的新型分子標記技術，由于SRAP標記的引物具有通用性，同時引物相對較長，為17或18個堿基，引物可以搭配使用，極大地降低了引物合成的費用。正是基于此優點，SRAP技術在果樹中得到了廣泛的應用，并取得了理想的效果。張四普等利用SRAP技術對石榴基因型進行了遺傳多樣性分析，經過聚類分析將23個石榴基因型分為5類。吳文珊等利用SRAP技術找到一個與薛荔性別相關的多態性片段，命名為FPme₁-em₂-em₁₄230。張春雨等利用SRAP技術對新疆野蘋果4個種下居群(鞏留群體、新源群體、霍城群體和裕民群體)的群體遺傳結構和遺傳多樣性進行了分析，結果顯示新疆野蘋果群體內變異高于群體間，鞏留群體遺傳多樣性最豐富，在制定新疆野蘋果原地和異地種質保護計劃時應優先考慮鞏留群體。本試驗采用蘋果的栽培品種和野蘋果基因組有一定差異，建立SRAP技術在蘋果栽培品種中的反應體系是很有必要的，以便為以后的重要農藝性狀分子標記以及蘋果分子遺傳圖譜的構建提供技術支持，為其他方面分子研究提供技術參考。

通過正交試驗對各因素進行優化，彌補了以往單因子優化的局限性，綜合了影響因子間的互作效應，建立了蘋果SRAP反應體系。結果顯示各影響因素中Mg²⁺影響最大，分析原因可能是Taq DNA聚合酶為Mg²⁺依賴性酶，而dNTPs中的磷酸基團能定量的與Mg²⁺結合，使其實際濃度下降，對Mg²⁺產生拮抗作用，Mg²⁺與2個影響因素都有關系。引物濃度也是影響SRAP擴增的一個重要因素，引物濃度過高，易引起堿基錯配產生非特異性擴增帶，還易形成引物二聚體；引物濃度過低，其與DNA模板結合位點減少，擴增量也隨之減少。作者在試驗中發現拖尾現象也可能與引物濃度過低有關，還有待進一步研究。dNTPs是PCR擴增的原材料，過少則不能完全擴增，過多則會與Taq DNA聚合酶競爭Mg²⁺影響酶的活力。TaqDNA聚合酶也對反應體系有一定影響，酶量過少不能充分催化反應進行，過多可能會引起電泳背景過深。相比較而言，模板DNA的量對擴增結果影響不大，說明SRAP反應體系對模板DNA濃度要求不是很嚴格。

從本試驗結果可以看出，不同的體系擴增出的產物電泳譜帶差異較大，說明其擴增結果易受反應條件影響。因此針對不同的試材及試驗條件需要優化反應條件。本試驗進行了不同影響因子的正交試驗設計。結果表明模板濃度對擴增結果影響不大，這與柿、櫻桃上的報道相一致。相比較而言，Mg²⁺、引物濃度、dNTPs以及TaqDNA聚合酶對擴增結果影響較大，這與櫻桃上報道的也相一致。本試驗通過優化最終確定的濃度與荔枝、柿、龍眼等有所不同，分析原因可能是物種間基因組差異較大所致。張春雨等對新疆野蘋果進行了群體遺傳結果和遺傳多樣性分析也是采用了SRAP技術，本試驗建立的體系與張春雨等人采用的體系在各影響因素中均有所不同，特別是模板濃度差距較大，本試驗所用模板為6mg·L^-1，而張的體系中模板濃度為0.33mg·L^-1，可能是栽培品種和野生種基因組差異較大所致。因此我們在應用SRAP標記對特定物種時應對其反應條件進行優化，從而保證反應分析體系的穩定性和重復性。

另外，王學軍等對包括蘋果在內的溫帶果樹的SRAP-PCR的退火溫度進行了優化，其反應體系用的是Li等的標準反應體系，反應的第一階段退火溫度與本試驗不同，第二階段是相同的。分析原因可能是反應體系不同導致了反應程序也有略微的差別，但從本試驗結果來看，利用已建立的反應體系，第一階段35℃退火溫度可以得到清晰、分布均勻、重復性好的擴增條帶。蘋果SRAP反應體系的建立將為蘋果分子遺傳圖譜構建、重要農藝性狀標記及基因定位提供新的支持。