基于EST數據庫的葡萄APETALA2基因cDNA克隆及其表達分析

摘要：APETALA2(AP2)是擬南芥生長發育特別是花器官發育過程中重要的調控基因。利用生物信息學方法以擬南芥APETALA2基因cDNA序列作為模板，對葡萄EsT數據庫進行同源檢索篩選，電子克隆出葡萄AP2基因(Vv-AP2)cDNA序列。以香悅葡萄花cDNA為模板，根據電子克隆的葡萄AP2基因cDNA序列設計特異引物，分別利用RACE技術和特異PCR技術獲得該基因3’末端和5’末端，序列拼接后獲得葡萄的APETALA2基因的cDNA全長。該cDNA的全長為2208bp，命名為(Vv-AP2。Vv-AP2核苷酸序列有一個1536bp完整的開放讀碼框(ORF)，其5’與3’末端非翻譯區分別為268bp和376bp。其中，3’末端含有28bp的Ploy⁺(A)。該基因在GenBank基因數據庫的注冊號為FJ809943。氨基酸推導結果表明該cDNA共編碼了511個氨基酸，具備完全保守的核定位信號序列(KKSR)以及2個高度保守的重復序列即AP2結構域。分別采用半定量RT_PCR和SYBR Green I實時定量RT-PCR初步分析了Vv-AP2在葡萄葉、莖、花序、花等不同器官中的表達水平。其中，Vv-AP2在花序和花中的表達量明顯高于葉和莖。

關鍵詞：葡萄；Vv-AP2；基因克隆；表達分析

中圖分類號：S663.1 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2010)02-207-06

APETALA2(AP2)是擬南芥一系列調節花發育的重要基因之一。AP2編碼一個轉錄因子，其最明顯的功能是參與調控花器官和種子的發育。AP2在擬南芥的所有營養器官及種子發育的各個階段均有表達，其不僅調控花分生組織特異性、花器官特異性、花器官數量、種子產量，而且在保持莖端分生組織中干細胞小區等方面也起著重要作用，有關其生理作用以及調控功能的研究一直受到重視。Lauter等在玉米中研究發現，AP2的同源基因(g10ssy15)在幼葉向成熟葉以及營養生長向生殖生長的轉型方面具有重要調控作用。因此，該基因可能在植物的整個生長發育過程，尤其是發育階段的轉變及生殖器官的發育中發揮重要作用。目前已經從擬南芥、蘋果、草莓、番茄、玉米、矮牽牛等植物中克隆到了AP2的同源基因。在矮牽牛和煙草的研究中還發現：它們的AP2同源基因與擬南芥中的AP2基因功能不盡相同，說明不同植物間AP2同源基因在功能上存在著一定的差異。在不同植物上開展AP2同源基因功能的分析對于認識基因的功能特點以及進一步利用具有重要意義。

葡萄(Viris vinifera)是世界性的重要果樹之一，也是繼擬南芥、水稻、楊樹之后完成全基因測序的第4種開花植物。葡萄一直是基因組學與后基因組學研究的重要植物材料，也是分子生物學研究的重要對象。Boss等在2000年預測在將來的20年中對葡萄基因以及基因功能的認識將促進通過基因工程手段對葡萄結果能力、果實成熟期以及植株生長習性等進行更有效調控。所有這些必將對葡萄產量與品質以及田間管理的操作產生重要影響。葡萄全基因組的測序無疑為這一預測的實現提供了重要保障。在葡萄上開展AP2基因功能的分析，不僅對認識葡萄花器官發育與童期的轉變等有著重要的理論價值，而且對在農業生產中更有效地利用該基因也具有重要的意義。我們采用生物信息學的方法以擬南芥AP2的基因序列為模板，對葡萄EST數據庫進行反復同源篩選、延伸，獲得葡萄AP2cDNA的全長序列，并以香悅葡萄花cDNA為模板，經RACE技術、電子克隆和RT-PCR技術獲得葡萄的cDNA全長，命名為VvAP2，并對其核苷酸及氨基酸序列特征以及在葡萄不同器官中的表達進行了分析。

1 材料和方法

1．1 電子克隆

根據不同物種間同源基因的核酸序列相對保守的特點，在GenBank的核酸(nr/nt)數據庫中檢索擬南芥的AP2基因序列(U12546)，并以U12546序列為探針對葡萄屬EST數據庫進行BLAST檢索，獲得與擬南芥AP2基因同源的葡萄EST片段：從獲得的葡萄EST片段中選出同源性最高的一條EV231889，再對葡萄EST數據庫進行BLAST檢索，得到多條與之高度同源的葡萄EST序列。將獲得的EST序列用DNAStar軟件進行首尾拼接，獲得新的Contig，進一步將獲得的Contig反復對葡萄EST公共數據庫進行BLAST檢索、拼接，最后獲得目的基因的電子克隆全長cDNA。

1．2 實驗克隆

1．2．1 材料 3a生葡萄的葉、莖(莖為當年新梢頂部第2、3、4節間的莖段)、花序、花(花為未盛開的花朵)于2008年4月下旬到6月下旬采自江蘇省南京市江寧區湯山果園(南京農業大學試驗基地)。大腸桿菌(Escherichia coli)菌株DH5α由本實驗室保存。PowerSeript Ⅱ^TMTM反轉錄酶購自Clontech公司，DNase酶I、LA-Taq酶、Ex-Taq酶、pMD-18T載體、dNTP、DNA Marker購自TaKaRa公司，Tfizol Reagent購自Invitrogen公司，熒光定量染料SYBR Green I購自東洋紡(上海)生物科技有限公司，DNA回收試劑盒、DL 2000 Plus DNA Marker為北京全式金生物技術有限公司生產。各種引物由上海英俊生物技術有限公司(Invitrogen)合成，其編號及序列見表1。

1．2．2 RNA提取與純化 花組織總RNA的提取按照Trizol Reagent說明書進行。mRNA的純化采用Promega公司生產的PloyATtract mRNA IsolationSystem IV試劑盒進行。

1．2．3 eDNA合成 以mRNA為模板，引物P01反轉錄合成cDNA第一條鏈，引物P02延伸加帽子，空氣加熱條件下42℃保溫1h，75℃保溫10min，冰上冷卻2min后，-70cC保存備用。

1．2．4 基因3’和5’末端PCR擴增 以cDNA為模板用引物P03/P04進行PCR擴增獲得基因的3’末端(3’UTR區)。反應體系為50μL：LA-Taq酶0.50μL，10×PCR buffer(Mg^{2+plus)5μL，dNTP Mixture 4μL，cDNA 2μL，引物各1μL，反應參數為94℃預變性3min，5個循環，94℃30s、70℃30s、72℃3min、5個循環，94℃30s、68℃30s、72℃3min、25個循環，72℃延伸10min。瓊脂糖凝膠電泳檢測后用DNA回收試劑盒回收目標片段進行T/A克隆，DNA測序由上海博亞生物技術有限公司完成(下同)。用電子克隆獲得基因的5’末端(5’UTR區)，再根據電子克隆的序列，設計特異引物P05/P06，進行特異PCR獲得基因的5’末端。反應參數為94℃預變性3min，94℃30s、60℃30s、72℃2min、35個循環，72℃延伸10min。反應體系同3’末端擴增。}

1．2．5 基因ORF的擴增 以cDNA為模板用引物P07/P08進行PCR擴增，反應體系為50μL：cDNA 2μL，引物各2μL，Ex-Taq酶0.50μL，10×PCR buffer(Mg^{2+plus)5μL，dNTP Mixture 4μL，cDNA 2μL，引物各1μL，反應參數同上。}

1．2．6 生物信息學分析 利用DNAMAN5.22軟件對Vv-AP2的ORF、3’末端和5’末端等3個序列進行拼接分析：該基因的核苷酸和氨基酸序列分別利用NCBI的BLASTn和BLASTp(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)與蘋果M-AP2(AF332215)、枳AP2(EU883665)、擬南芥AP2(U12546)、矮牽牛PhAP2A(AFl32001)、豌豆AP2(AAKl4326)、番茄AP2(ACD62792)、松樹AP2(BADl6603)、水稻AP2(AA065862)、玉米AP2(ABRl9870)的相應序列進行相似性分析。

1．3 葡萄Vv-AP2基因的表達分析

從不同葡萄器官中提取的總RNA用DNase I酶(RNase free)消化和氯仿抽提后分別取2μg以P01引物反轉錄合成的cDNA做模板，用Primer-BLAST

(http://www.ncbi.nlm.nih.zov/tools/Drimer-blast)設計的引物P11和P12進行半定量RT-PCR和實時定量PCR研究Vv-AP2在不同器官中的表達特點。為確保半定量RT-PCR和實時熒光定量PCR的特異性，引物P11與P12被設計在Vv-AP2基因的3’非翻譯區(3’UTR)。內標基因是利用葡萄Ubi的特異性引物(P09和P1O)PCR擴增獲得的長度為141bp的基因片斷。利用Rotor-Gene熒光定量PCR儀進行實時定量RCR的反應體系按SYBRGreen I(TOYOBO)說明書進行，其優化后的反應條件為：95℃預變性60s，95℃15s、57℃15s，72℃208、45個循環，每實驗3次重復，實驗數據用Lin-RegPCR(Ramakers et al.，2003)和Excel軟件分析。

2 結果與分析

2．1 葡萄Vv-AP2 cDNA全長的電子克隆

利用擬南芥U12546為信息探針，對葡萄EST數據庫進行BLAST檢索，得到1個保守性高的EST序列EV231889，然后以此序列作為種子序列BLAST檢索葡萄EST數據庫，將檢出的與種子序列同源性較高的或有部分重疊的EST序列(CB922024，CF511859，CB974375，EC953584，CF511859，EV231890，CB974442)拼接組裝為重疊群(Contig)，再以此重疊群序列重復以上BLAST檢索過程，反復進行EST重疊群序列的拼接和比對，最后獲得長度為2208bp的Vv-AP2 cDNA全長序列。

2．2 葡萄Vv-AP2 cDNA全長的獲得

根據電子克隆的Vv-AP2的cDNA全長設計特異引物P03，以葡萄花器官來源cDNA為模板，與引物t)04進行3’RACE擴增，經克隆測序得到該基因的3’末端(1012bp)，用電子克隆得到該基因的生物信息學的5’末端，即5’UTR區(268bp)，根據電子克隆的序列設計特異引物P05/P06，并用特異PCR擴增，經克隆測序獲得該基因的5’末端，經BLAST比對與電子克隆的序列相一致。利用引物P07和P08，以葡萄花器官來源cDNA為模板獲得長度為1536bp的全長ORF。對3’端、5’端以及ORF全長拼接獲得Vv-AP2的cDNA全長為2208bp。Vv-AP2的全長序列包括長度為1536bp的開放閱讀框(ORF)，268bp的5’非翻譯區(5’UTR)，376bp的3’非翻譯區(3’UTR)以及28bp的poly^{+(A)。該基因在GenBank基因數據庫的注冊號為FJ809943。}

2．3 葡萄APETALA2的ORF區及其氨基酸序列與分析

由VvAP2 cDNA的ORF區推導共編碼511個氨基酸(圖1)，并對該序列進行分析發現，Vv-AP2編碼的氨基酸序列與其他植物的AP2氨基酸序列均有2個具有高度保守的序列即AP2結構域，該結構域可以識別DNA順式作用元件(Cis-acting Ele-ment)并與之結合。用DNAMAN5.22軟件將其與擬南芥的AP2結構域相比具有高度的同源性，分別為96.5％和94.1％：在其第143～152氨基酸還含有1個堿性區域，內含核定位信號KKSR，且該序列與擬南芥的核定位信號序列完全相同；在VvAP2的N端第15～28氨基酸還含有一段富含絲氨酸的轉錄激活區域，該區域是3個典型轉錄因子(AP1、AP2、LFY)的序列之一，具有促進該基因轉錄的作用。上述結果表明，從葡萄中分離出的目標基因是AP2的同源基因。

用DNAMAN5.22軟件對葡萄AP2氨基酸序列與蘋果M-AP2(AF332215)、枳AP2(EU883665)、擬南芥AP2(U12546)、矮牽牛PhAP2A(AF132001)、豌豆AP2(AAK14326)、番茄AP2(ACD62792)、松樹AP2(BAD16603)、水稻AP2(AA065862)、玉米AP2(ABR19870)的相應序列進行同源性比較，結果表明：葡萄AP2氨基酸序列與矮牽牛、枳、蘋果的AP2的同源性較高，分別為67.5％、65.5％和64.7％，與豌豆、擬南芥、番茄、松樹、水稻的同源性為58.2％、49.5％、48.2％、42.9％、36.2％，與玉米的同源性最低僅為35.7％。這些AP2同源基因氨基酸序列同源性的不同表明它們在功能上可能存在著一定的差異。例如，矮牽牛和煙草的AP2類似基因與擬南芥中的AP2基因功能就不盡相同。上述植物的AP2氨基酸序列的系統樹(圖2)分析也顯示了相似的結果：葡萄AP2氨基酸序列與矮牽牛、枳、蘋果的AP2的進化關系較近，與水稻、玉米等的親緣關系較遠；總體上是雙子葉植物的氨基酸序列的相似性高于松科和單子葉植物。

2．4 Vv-AP2在葡萄不同器官中的表達分析

采用半定量RT-PCR法對Vv-AP2基因進行器官特異性表達分析(圖3)，結果表明，在葉、莖、花序、花等各器官均擴增出大小約為150bp的片段，經克隆測序獲得該擴增片段的精確長度為141bp，且該片斷均為Vv-AP2的3’UTR片斷，與引物設計的預期擴增序列相一致。盡管Vv-AP2在葡萄上述器官均有表達，但存在著一定的表達差異，Vv-AP2在花序和花中的表達水平明顯比葉和莖高。進一步用熒光定量PCR方法檢測在各器官中的表達量(圖4)，得到與半定量RT-PCR相一致的結果。Vv-AP2在葡萄葉、莖、花序、花等不同器官均能表達的特點說明該基因編碼的蛋白是一種普遍存在的轉錄因子，而其在這些不同器官中表達水平的不同則又說明了該轉錄因子在不同器官發育過程中所起的作用大小存在差異。

3 討論

盡管葡萄是第4種全基因組測序的開花植物，但是由于葡萄高效遺傳轉化體系建立的難度大，葡萄功能基因組學研究明顯滯后于擬南芥、水稻等模式植物。以生物信息學為基礎的基因克隆措施仍然是獲得與認識葡萄重要性狀關鍵調控基因的主要手段。本研究以擬南芥APETALA2基因的cDNA序列作為模板，對葡萄EST數據庫進行同源檢索篩選，電子克隆出Vv-AP2基因的cDNA序列，進一步以葡萄花cDNA為模板以及葡萄cDNA序列對應的特異引物，分別利用RACE技術和特異PCR技術成功獲得了Vv-AP2基因的cDNA全長。本研究對于克隆葡萄以及其他果樹的基因具有一定的參考價值。

基于對ap2突變體的分析，人們發現擬南芥中AP2基因不僅在花瓣和萼片的形成過程中起重要作用，而且與AP1、LFY及CAL等花的分生組織決定基因相互作用，共同參與花分生組織的早期建立，如：花分生特性的建立，花器官特性的特化和花器官形成的調節，花同源異型基因活性的時空調節。Jofuku等報道，AP2不僅在擬南芥的花分生組織和四輪花器官中表達，在莖、葉等營養器官中亦有表達。宿紅艷等采用RT-PCR方法分析SAP2在草莓不同組織中的表達情況，結果顯示SAP2在草莓營養組織、花芽以及不同花器官中均有表達。因此，該基因在植物的各個生長發育階段，尤其是生殖器官的發育中發揮重要作用。本研究從葡萄花cDNA中成功分離出AP2的同源基因Vv-AP2，該基因編碼的蛋白質具有AP2家族典型的特征，并對包括葡萄在內的10種植物的AP2同源基因的氨基酸序列進行同源性比較，它們的同源性存在不同程度上的差異，而且它們在核定位信號序列和AP2結構域之外的序列差別較大：接著采用半定量RT-PCR和熒光定量PCR對Vv-AP2在葡萄不同組織中的表達情況進行分析，得到與在擬南芥、草莓、玉米中相似的結論，說明Vv-AP2對葡萄營養與生殖器官的發育都具有一定作用，但作用的大小可能存在著差異，進一步驗證了Vv-AP2在葡萄不同空間表達的差異性，關于其在葡萄不同時期表達，將是我們的另一相關實驗中研究的內容，本文不再多做描述。

為了更充分地認識Vv-AP2的功能，我們將利用構建Vv-Ap2正義和反義表達載體通過轉化葡萄開展更深層次的基因功能分析。此外，關于Vv-AP2調控哪些下游基因、如何調控這些基因來影響花的發育等方面的問題，目前還不太清楚，也將是我們進一步研究Vv-AP2的一個方向。