水果過敏及其過敏原基因組學研究進展

摘要：水果是我國十類主要過敏食物之一，水果過敏與人體遺傳、環境和水果種類等多因素相關，常與花粉過敏發生交叉反應，是影響農產品安全和人們生活質量的新問題。水果過敏癥狀包括輕微的口腔過敏綜合癥和較嚴重的全身系統性反應。水果中過敏蛋白是過敏疾病的誘因，主要為病程相關蛋白、抑制蛋白和一些酶類物質。早期應用免疫學方法鑒定了一些水果過敏原的分子量范圍，近幾年通過基因組學和蛋白質組學研究，確定其蛋白性質和結構特性。蘋果和桃過敏原基因家族的不同成員已定位到國際參照連鎖圖譜上，這為研究不同品種的過敏性差異以及選育低過敏品種奠定了基礎。人們已通過RNA干擾等基因工程技術獲得蘋果和番茄等作物的低過敏植株。首先簡要介紹水果過敏的歷史、發病機制、國內外臨床數據和過敏癥狀，其次以薔薇科為例論述相關過敏蛋白家族以及結構，重點介紹了過敏原基因組學最新研究成果，并探討了低過敏品種培育的新途徑以及過敏診斷和治療新方法。

關鍵詞：水果過敏；過敏原；基因定位；重組蛋白

中圖分類號：S66 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2010)02-281-08

水果因含有豐富的營養物質以及愉悅的風味而被人們推薦為健康食品，但伴隨人們消費水果的種類和數量的增加，水果生產專業化以及銷售網絡遍及世界各地，水果過敏逐漸成為全球性問題。水果過敏研究最早于上世紀50年代在歐洲開展，在近10a采取多學科交叉模式的歐盟兩個框架計劃(EU-PROTALL和EU-SAFE)中把水果過敏列為改善和提高生活品質的優先主題，取得了重要進展。我國在水果過敏基礎研究方面尚處于起步階段，可以借鑒國外研究經驗開展相關研究。我們根據國內外水果過敏研究動態和最新成果，簡要介紹與水果過敏發生相關知識基礎上，著重評述水果過敏原基因組學研究進展以及遺傳育種應用前景。

1 水果過敏疾病的臨床免疫學研究

1．1 水果過敏的流行病學調查和臨床表現

人們對水果過敏的認識經歷了一個漫長的階段。1819年John Bostock首先描述了枯草熱(Hayfever)。1942年首次發現了花粉過敏與水果過敏間的關聯，報道癥狀和枯草熱相似但發病部位僅局限于口腔周圍。后來發現，一些水果與許多常見花粉間都存在較高的交叉過敏現象，并且發病部位也擴大到了另一些器官。例如1982年在歐洲中北部統計發現有70％對樺樹花粉過敏的患者經常對一些水果、蔬菜以及堅果過敏。1995年，靠近地中海的西班牙和意大利大量報道了桃過敏導致的較嚴重的全身系統性癥狀。

引發過敏反應的水果種類分布廣泛，常見于蘋果(Malta domestica)、桃(Prunus persica)等薔薇科水果以及菠蘿(Ananas comosus)、杧果(Manngifera indi-ca)等。水果過敏的發生與水果種類、地理位置、環境條件、加工程度、人類種群等差異有關。據調查估計，歐洲大約有2％～5％的人口對薔薇科水果過敏。據估計，我國食物過敏總人數約有4000～5000萬人，占總人口的3％～5％，其中水果是十類主要致敏食物之一。我國尚無系統的水果過敏統計數據，相關文獻以病例報告居多。

常見水果過敏癥狀可分為輕微口腔反應和全身系統性反應。前者癥狀僅出現在口腔周圍，發病輕微，表現為發癢、腫脹等，稱為口腔過敏綜合癥(OralAllergy Syndrome，OAS)。后者可在多種器官中觀察到，例如皮膚(局部或全身蕁麻疹，遺傳性過敏濕疹)，胃腸道(腹部絞痛，腹瀉，嘔吐)，鼻和肺(鼻炎和哮喘)，心血管系統(過敏性休克)等。但有學者認為，國內水果過敏癥狀與國外不同，主要為全身性表現，僅為口腔癥狀者罕見。如國內報道杧果過敏癥狀為接觸性皮炎。患者在接觸部位出現紅色斑疹、丘皰疹、水皰疹，有不同程度的瘙癢或灼熱感，嚴重時會出現休克等系統癥狀。荔枝(Litchi chinensis)可引起過敏性哮喘、蕁麻疹、過敏性紫癜、過敏性皮炎、搔癢癥和呼吸困難等。另外，菠蘿、獼猴桃(Actini-dia chinensis)、香蕉(Musa sapientum)等均有皮膚、消化道及過敏性休克癥狀出現。

1．2 水果過敏反應發生機理

水果過敏是患者的免疫系統(由免疫球蛋白IgE介導)對水果中的一些蛋白成分(過敏原)發生的過激反應而導致的病理損傷。水果過敏屬I型或速發型超敏反應(typeI hypersensitivity)，這一類型疾病影響全球大約25％的人口，包括致敏階段、激發階段和效應階段。在嬰幼兒時期，由于胃腸道尚不健全，通透性高，水果或花粉中的過敏原進入到體液中，可以選擇性誘導抗原特異性B細胞產生IgE抗體應答，活化漿細胞產生特異性IgE，后者與嗜堿性粒細胞及肥大細胞表面的IgE Fc受體結合完成致敏過程。正常人群可產生免疫耐受。激發階段，過敏原進入體內與結合在肥大細胞或嗜堿性粒細胞表面的IgE抗體特異性結合，使之脫顆粒，釋放出組胺、5-羥色胺、白三烯、前列腺素及嗜酸性粒細胞趨化因子等大量生物活性介質，作用于效應組織和器官，引起局部或全身過敏反應。過敏性疾病是由多基因控制的遺傳病，其發生是一個多因子互作的結果，主要取決于人本身的遺傳、環境影響的免疫系統和食物中特定蛋白質的性質和數量，涉及過敏原、過敏性抗體(主要是IgE)、細胞、受體和細胞成分5個環節。

1．3 水果過敏與花粉等過敏的交叉反應

在調查中發現，一些過敏患者不僅對同一科(或屬)內水果有普遍的過敏反應，而且對非同科蔬菜、草木花粉或乳膠(1atex)也有過敏反應。應用RAST抑制試驗和免疫印跡等技術，發現有它們有幾種共同的過敏蛋白組分。進一步研究表明，過敏蛋白高級結構中的表位結構域是其免疫原性及其與IgE相互作用的決定因素，并構成免疫交叉反應的基礎。常見交叉反應包括花粉食物綜合癥(Dollen food syn-drome，PFS)和乳膠一水果綜合癥(latex-fruit syn-drome)等。前者主要涉及樺樹、艾蒿和牧草等花粉，因花粉致敏并由水果、蔬菜同口腔粘膜接觸而引發。后者常發生在獼猴桃、香蕉、杧果、菠蘿等水果中。

2 水果過敏原研究現狀

2．1 過敏原的鑒定與命名

過敏原(allergen)是指能刺激機體發生過敏反應的物質。過敏原誘發機體產生高水平的特異IgE(即其免疫原性)是發生過敏反應的關鍵。過敏原的鑒定源自臨床免疫醫學，鑒定內容主要包括蛋白分子大小測定、結構分析、理化屬性、IgE結合位點以及致敏性的鑒定等。經典的方法通常是從致敏材料中分離提取過敏原，通過SDS-PAGE確定分子量，然后利用過敏患者血清通過Western blotting免疫印跡技術，鑒定其免疫活性，雙向電泳的應用使同一類過敏原的不同成員可按其等電點和分子量分離。而近10a，基因克隆和質譜測序技術的應用加快了過敏原鑒定的步伐，通過分子生物學和臨床免疫學較全面地鑒定了過敏原蛋白組分和性質，水果過敏原數據庫內容也迅速增加。

國際免疫學會聯合會(I.U.I.S)下屬的過敏原命名專門委員會(Allergen Nomenclature Sub-commit-tee)(http://www.allergen.org)制定了系統的命名規則。命名主要根據過敏原來源物種的拉丁名，如桃(Prunus persica)過敏原用Pru p符號表示，再根據蛋白類型以及序列相似度又細分為同工型(isoaller-gen)和變型(variant)。主要過敏原(major allergen)是對50％以上的過敏病人血清均能發生明顯反應的一類過敏原，低于50％的為次要過敏原(minor al-lergen)。廣泛分布于植物王國并存在交叉過敏的過敏原稱為泛過敏原(pan-allergen)。

2．2 水果過敏原蛋白家族聚類

基于已知的基因編碼序列和部分過敏原的三維結構信息，大多數過敏原均可按照相似的空間結構和結構域歸類到少數有共同生物學特性的蛋白家族中。根據I.U.I.S.過敏原命名官方網站、Allfam數據庫(http://www.meduniwien.ac.at/allergens/allfam/)和Allergome數據庫(http://www.allergome.ortg/)分析，水果過敏原只分布于少數限定功能的蛋白家族中(表1)。這些蛋白主要為病程相關蛋白(PR蛋白)、蛋白酶及蛋白酶抑制劑(如幾丁質酶)、運輸蛋白(如脂質轉移蛋白)、結構蛋白(如抑制蛋白)等。另外，部分水果過敏原來源于其他一些非聚類蛋白，如甜瓜(Gu-cumis melo)過敏原Cucm1為堿性絲氨酸蛋白酶(Alkaline serine protease)，番茄(Lycopersicon escu-lentum)過敏原Lvce2為β-呋喃果糖苷酶。

病程相關蛋白(pathogenesis-related proteins)是植物體在受到外界逆境、病原菌刺激后產生的一種或幾種上調蛋白，目前發現它的14個家族中5個成員為過敏原(表2)。PR蛋白是導致許多交叉過敏現象發生的原因，因其在水果過敏中占據重要地位，人為選育的對環境逆境和病原菌有較高抵抗能力的栽培品種可能會導致這些水果致敏性的增強。水果多種蛋白酶都可誘發過敏反應，如半胱氨酸蛋白酶就包括菠蘿蛋白酶(bromelain)、獼猴桃蛋白酶(ac-tinidin)、木瓜蛋白酶(papain)以及無花果蛋白酶(ficin)，但相關致敏研究少見報道。水果過敏蛋白家族以薔薇科果實研究最為深入，主要有4類蛋白家族，包括病程相關蛋白第10家族(PR-10)，非特異脂質轉移蛋白(nsLTPs，PR-14蛋白)，抑制蛋白(profilin)和類甜蛋白(TLP，PR-5蛋白)。每個家族由多個基因成員編碼，同一種果實中含有潛在的多種過敏原種類和同工型。本文以這4類家族為例加以介紹。

2．2．1 病程相關蛋白第10家族(PR-10) 花粉食物綜合癥所涉及最多的一類病程相關蛋白是PR-10家族，它由細胞內的一些具有酶活性的蛋白組成，廣泛分布于植物界并具有高的保守性，受微生物侵染、傷害和脅迫條件誘導表達。樺樹主要過敏原Betv1是這個家族的代表性成員，有70％的樺樹花粉過敏患者對一些食物有交叉過敏。許多薔薇科水果中所含過敏原與Betv1有較高的同源性，如蘋果的主要過敏原Mald1與Betvl同源性達63％。這些過敏原包括蘋果(Mald1)、梨(Pyrc1)、杏(Pru ar 1)、甜櫻桃(Pmav1)等，分子量約為18ku，二級結構預測存在幾乎相同的結構元素，特別是“P一環”區，為花粉相關食物過敏原和發病機理相關蛋白的共同區域。

2．2．2 類甜蛋白(Thaumatin Like Protein.TLPs.PR-5蛋白) 由于與甜蛋白的高度相似性，病程相關蛋白第5家族也被稱為“類甜蛋白”。它是一類在脅迫條件下大量積累的抗真菌蛋白，可以增強植物抵抗冰凍和干旱逆境的能力，但全部功能尚不清楚。TLP作為水果過敏原首次在蘋果(Mald2)中發現。在甜櫻桃(Prunus avium)中，一個23ku，p14.2的TLP蛋白(Pruav2)被認為是主要過敏原。TLP和nsLTP具有相似的二硫鍵結構，使蛋白分子具有熱穩定性并能抵抗酶的水解。

2．2．3 非特異脂質轉移蛋白 (non-specific lipidtransfer protein，nsLTPs，PR-14蛋白) nsLTPs是一類小分子可溶性蛋白，隸屬于病程相關蛋白第14家族，在高等植物中占全部可溶性蛋白的4％。根據分子量的大小，植物nsLTPs可分為2大類，即nsLTPl和nsLTP2，分子量分別為9和7ku。nsLTPs具有良好的穩定性，在4℃可貯存數月之久，在高溫下也有較好的穩定性，能耐100℃高溫而結構不發生變化，即使在有變性劑存在情況下也十分穩定。植物nsLTPs參與多種生物學過程，可能具有的生理功能包括在體內參與角質單體合成、表層蠟質的生成、體細胞胚胎發育、開花、抑制半胱氨酸蛋白酶以及對各種環境脅迫，如干旱、熱、冷、鹽和溫度變化的適應性應答。薔薇科水果中的nsLTP蛋白是主要過敏原，屬于nsLTPl類，含有91個氨基酸殘基，pI≥9，包含由4個高度保守二硫鍵連接的4個a-螺旋結構的穩定球狀體。地中海地區報道很多水果過敏患者有輕微口腔過敏綜合癥，但并不對花粉過敏，同時嚴重的系統性癥狀常有報道，這種現象可能與nsLTP蛋白有關。涉及的過敏原有桃(Prup3)、蘋果(Mald3)、杏(Pruar3)和李(Prud3)等。這些過敏原同源性較高，且主要分布于果皮，如蘋果與桃的nsLTP蛋白同源超過90％。

2．2．4 抑制蛋白(profilin) 抑制蛋白是一個小的細胞溶質蛋白(eytosolie protein)，具有結合肌動蛋白功能(aetin-binding)。存在于所有真核細胞中。在植物中抑制蛋白序列的同源性很高，一般為71％～85％，并且其序列長度也很保守，大約14ku。其在真核細胞中主要是控制肌動蛋白的聚合閉。1991年，樺樹的次要過敏原Betv2被鑒定為profilin，從而引起了過敏研究者的關注。大量的profilin基因在不同的植物，如小麥、菜豆、西紅柿、牧草中被克隆，其免疫學特性也有研究。Profilin不僅在花粉中存在，而且在水果和蔬菜中也都存在，如梨Pyrc4、櫻桃Pmav4、桃Prup4等。水果中抑制蛋白較難純化，僅有少數重組蛋白報道。

2．3 過敏原結構及與抗體結合表位鑒定

過敏原表位(epitope)是指過敏原中參與結合免疫系統的免疫細胞或抗體的組成部分。水果過敏原中不同類型的表位存在著差異，是導致水果過敏復雜性的關鍵物質基礎之一，而不同植物過敏原分子結構上共同的表位則是免疫交叉反應的基礎。根據過敏原表位與細胞結合方式的不同可分為B細胞表位和T細胞表位；根據表位結構的不同，又可分為連續性過敏原表位(線性表位)和不連續性過敏原表位(構象型表位)。線性表位主要是識別過敏原中的特定的氨基酸序列，一般比較多見，而且易于定位；而構象型表位是一些不連續的氨基酸通過分子內及分子間相互作用形成，一般不穩定，隨著三級結構的破壞，其表位也會破壞，同時可能會產生新的表位。水果中nsLTP家族的過敏原表位研究比較深入。蘋果、梨、杏和李等水果的nsLTP蛋白IgE表位占過敏原分子表面40％以上，已經鑒定4個表位，其中兩個表位為線性表位。其中桃主要過敏原(Prup3)的晶體結構和過敏原IgE表位已經確定，最近又鑒定了桃過敏原Prup3上與T淋巴細胞相互作用的T細胞表位。

3 水果過敏原基因組學研究和應用

3．1 基因組學研究

人們很早就注意到不同品種致敏性有顯著差異。早期用免疫印跡定量總蛋白的方法分析品種致敏性差異，發現個別低過敏品種表達的過敏蛋白較少，但目前仍不清楚激發的閾值，增加多個品種研究后對其量的差異也無一致結論。10a前僅通過純醫學的試驗方法和個別基因序列的簡單比較也未得到很好的解釋。最近基于基因測序和表達的研究表明，同一種果實中含有潛在的多種過敏原種類和同工型，多成員間存在致敏性的差異，從而解釋品種致敏性差異及過敏癥狀的地域間差別。在過敏原各組分間結構和致敏性差異分析基礎上，結合品種致敏性臨床數據，進行表型關聯分析，可以探明品種致敏性差異的分子機理，加速低過敏品種選育進程。目前相關研究主要涉及水果過敏基因克隆，遺傳圖譜定位、基因表達研究、環境調控和遺傳關聯分析等方面。

水果過敏原蛋白基因組序列特征以及遺傳圖譜定位等基因組學方面目前研究較少，只在薔薇科代表性果樹蘋果和桃較為深入。Gao等克隆分析了蘋果四類過敏原家族28個成員的DNA和氨基酸序列，應用SNP標記技術定位到國際公認的8條分子標記連鎖圖譜上。其中Mald1是引發歐洲中北部人群過敏的主要過敏原，其17個基因成員定位于3條連鎖群上，7個成員都含有1個內含子。對這7個基因在14個核心蘋果品種上進行了位點多樣性分析，發現Mald1.01和Mald1.02很保守，Mald1.04，Mald1.05和Mald1.06更富有變化性。根據品種間系譜關系以及主要親本的基因克隆和分子標記測定，并在另外10個品種上驗證，發現2個候選的基因Mald1.04和-1.06A位點變異(2個基因都位于16連鎖群)與過敏性相關，特別是Mald1.06A還呈現出位點的劑量效應，說明致敏性與質和量相關。開發了可用于過敏原基因資源評價以及育種選擇的低過敏性狀分子標記，如SSR標記Mald1.06A-SSR。

參考歐洲桃過敏原醫學鑒定成果以及桃果實EST庫相關序列，應用國際參照李屬連鎖圖譜和簡便作圖方法，Chen等把桃和扁桃中4類18個與蘋果同源的候選基因進行了定位。桃果實中十分重要的nsLTP家族成員都位于連鎖群G6底部，與抗病基因密切關聯。根據蘋果和桃過敏原基因推導氨基酸序列相似性和對應連鎖圖譜位置比較和分析歸納，確立和證實了桃和蘋果在連鎖群水平上宏觀水平的同一性(Macro-synteny)。蘋果和桃過敏原基因組學研究成果對于整個薔薇科仁果和核果類類似研究有普遍的參考價值，為挖掘低過敏特性的基因位點或組合奠定基礎。

對品種間致敏性差異的解釋需要分析過敏基因不同成員的表達模式，從而為利用生化和分子途徑獲得低敏品種提供基礎信息。早期研究使用免疫學手段鑒定過敏蛋白在果實內的相對含量，對其表達和亞細胞定位有了初步認識，但是仍無法獲得各基因成員的相對表達量，無法確定關鍵致敏性成員。近些年來，隨著熒光定量PCR技術和基于質譜的蛋白質技術的普遍應用，過敏原不同基因成員在mRNA水平和蛋白質水平上的表達研究得以深入開展。Botton等利用熒光定量PCR技術對蘋果和桃上部分成員在轉錄水平上的表達研究表明過敏基因不同成員在果實不同部位表達量不同。少數成員在蛋白質水平的表達得到了鑒定。在獲得完整的各基因成員表達信息后，可以進一步確定關鍵致敏性成員。

3．2 低過敏品種選育

降低食物過敏的發生是國際上預防醫學新課題，被動的避免接觸會引發系列的健康和社會學問題，發現鑒定培養低過敏品種無疑是一個積極的解決途徑。為此，歐洲在第五框架(EU-SAFE)設置了以蘋果為模式的降低過敏發生的研究項目，而且在第六框架水果綜合研究項目(ISAFRUIT)(2006-2010)中進一步深化蘋果和桃低過敏品種研究。由荷蘭瓦赫寧根大學和研究中心鑒定的世界首個低過敏蘋果新品種Santana已經在荷蘭上市，為北歐的蘋果過敏患者提供了新的嘗試選擇。隨著分子標記以及過敏基因的遺傳圖譜定位等基因組學知識的發展，利用RNA interference(RNAi)等手段，結合傳統育種技術，選育低敏轉基因品種更為便利。通過RNAi途徑已經得到低敏轉基因番茄果實和Mald1沉默的轉基因蘋果植株。

3．3 應用重組蛋白進行免疫治療與檢測

過敏診斷傳統采用各種水果粗提蛋白作為診斷試劑，質量和數量變化大，不同批次難比較，在標準化控制上有很大的弊端。獲得大量高純度的過敏原并分析其表位結構域是準確診斷及治療過敏疾病的先決條件。傳統的脫敏治療中所使用的天然過敏原提取物存在組分復雜、質量難以控制等諸多隱患而使其應用受限，通過基因工程的方法合成的修飾后的高純度特異過敏原，在保持過敏性蛋白完整的免疫活性的同時可降低其自身的過敏原性。這種修飾后的過敏性蛋白的應用將使免疫治療更趨于標準化，同時避免應用天然過敏性蛋白時的危險性，最終可達到提高治療效果的目的。目前該方法已經成功地將過敏原基因在大腸桿菌、酵母、病毒和植物等不同的表達體系中重組，被表達的過敏性蛋白分布在包括動物、植物、真菌、螨類等幾乎所有的過敏原種類。國內已經開展應用大腸桿菌生產具有免疫活性的豚草、蟑螂、蕎麥、塵螨、杧果過敏蛋白，國外擴展到在酵母和煙草葉片或懸浮細胞培養體系表達重組蛋白。已有大量水果過敏原，如蘋果、桃、甜櫻桃等中的過敏原通過重組途徑獲得。通過與天然過敏原在表位結構、免疫活性、翻譯后修飾等領域對比研究，表明重組過敏原具有近似于天然過敏原的性質，進而應用到治療與診斷當中。

4 結語與展望

隨著社會和經濟的快速發展與衛生環境的變化，我國面臨著西方國家同樣的過敏增長問題，然而國內研究尚處于起步階段，沒有做好充分的應對準備。近年，國內學者開始關注這一問題，嘗試組織包括醫學、食品、農業、環境和社會科學等多學科交叉的協作團隊，聯合國內外科研單位和公司，共同解決多因素控制的過敏問題，利用基因組學、蛋白組學、免疫學技術等手段，在過敏機理、診斷與治療、過敏原鑒定、種質創新等領域做深入研究。重要研究方向和思路包括：(1)我國水果過敏原蛋白免疫學以及分子鑒定。目前國外已經鑒定了大量水果過敏原，而鑒于過敏患者有地域差別的特點，國內研究需要注重國際間比較和交流合作，探明我國主要過敏源材料及相應過敏原類型，深入研究過敏原免疫活性并進行表位結構鑒定，同時需將研究材料擴大到我國特色果樹。(2)果實候選過敏原基因表達模式分析及功能鑒定。過敏原在植物體代謝進程中有重要作用，如與抗病或運輸相關等。基因組測序研究發現了大量候選過敏基因成員并定位到國際參照連鎖圖譜上，基于此進行RNA水平定量試驗和蛋白質水平質譜鑒定及測序，研究其表達模式，為關鍵成員遴選及功能差異分析提供幫助，桃上最新研究為此類工作提供借鑒。(3)低過敏種質資源的篩選及培育。品種間果實致敏性差異不同，篩選低過敏種質資源為過敏預防開辟新的道路。根據過敏基因在蘋果及桃的遺傳圖譜位置，開發緊密連鎖SSR分子標記，分析過敏基因的遺傳多樣性具有重要意義。(4)特異過敏基因干擾抑制表達。基因干擾技術已經成功應用于蘋果和番茄等食物過敏原材料，隨著基因組研究的深入，這一技術的應用范圍將擴大到其它物種。(5)重組蛋白用于治療和診斷。國外用于治療過敏的重組蛋白已有商業制劑，為食物過敏的治療和診斷提供良好前景。桃、杧果等一些我國重要的過敏原重組蛋白制劑已經開始研發，根據不同過敏原的特性選擇合適的表達體系使其具有免疫活性是較重要的科學和技術問題。